Page 67 - 《中国药房》2021年第9期

2.6 细胞中 AMPK 信号通路各关键因子 mRNA 表达 液显色后，使用高灵敏度化学发光成像仪曝光成像。采
检测 用 Image Lab 5.2.1 软件对目的条带进行灰度值分析，以
采用实时荧光定量 PCR 法检测 AMPK 信号通路上 p-AMPK 与 AMPK 条 带 灰 度 值 的 比 值（即 p-AMPK/
游关键因子 APN、AdipoR2、APPL1、AMPK 以及下游胰 AMPK 比值）表示后者的磷酸化水平，结果均以正常组
岛素信号通路关键因子IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA表 为标准进行归一化处理。实验重复3次。
达情况。取对数生长期的 HepG2 细胞适量，以 1.2×10 5 2.8 统计学方法
个/孔接种于 6 孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模、给 采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析，采用
药。各组细胞培养 24 h 后，弃去上清液，细胞经 TRIzol Graph Pad Prism 7.0 软件作图。数据均以 x±s 表示，多
法提取总 RNA 并根据 Transcriptor cDNA Synth. Kit2 试 组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD
剂盒说明书方法逆转录合成 cDNA。以 cDNA 为模板， 检验（方差齐）或 Dunnett’s T3 检验（方差不齐）。P＜
参照Fast Start Universal SYBR Green Master试剂盒说明 0.05为差异具有统计学意义。
书配制 PCR 扩增体系，混匀后，使用荧光定量基因扩增 3 结果
仪进行 PCR 扩增。反应体系（共 20 μL）包括：cDNA 模 3.1 MGF对IR-HepG2细胞糖代谢的影响
板 2 μL，2×SYBR Green Ⅰ Master 10 μL，上、下游引物 与正常组比较，模型组细胞的校正葡萄糖消耗量显
（其引物序列及产物大小见表 1）各 0.5 μL，ddH2O 7 μL。 著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组细胞的校正
反应条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃ 葡萄糖消耗量均显著升高（P＜0.01），详见表2。
退火 30 s，共 40 个循环。以β-actin 作为内参，采用 2 －ΔΔCt 表 2 MGF 对 IR-HepG2 细胞校正葡萄糖消耗量和
法以 QuantStudio 7 RT-PCR System（Version 1.1）软件计 TG、TC含量的影响（x±±s，n＝3）
算各目的基因mRNA的相对表达量，结果均以正常组为 Tab 2 Effects of MGF on corrected glucose consump-
标准进行归一化处理。实验重复3次。 tion，TG and TC content in IR-HepG2 cells
表 1 AMPK 信号通路各关键因子 PCR 引物序列及产
（x±±s，n＝3）
物大小
组别 校正葡萄糖消耗量，mmol/L TG含量，mg/g TC含量，mg/g
Tab 1 PCR primer sequence and product size of key 正常组 2.92±0.09 205.40±6.97 18.64±1.21
factors in AMPK signaling pathway 模型组 2.32±0.26 ＊＊ 253.70±22.97 ＊＊ 27.44±1.16 ＊＊
阳性对照组 4.27±0.12 ## 211.48±8.55 ## 18.08±1.82 ##
产物大 3.36±0.12 ## 209.22±12.71 ## 19.94±1.04 ##
待测基因 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） MGF高剂量组
小，bp ## ## ##
MGF中剂量组 2.87±0.06 199.28±5.58 20.34±1.28
上游关键 AdipoR2 CCCTCATGATGTACTACCAGAC GTTGCCTGTTTCTGTGTGTATT 127 MGF低剂量组 2.79±0.21 ## 189.07±7.61 ## 20.71±3.07 ##
因子 APN GAAGGACAGCCAGTATGAGATG GGATAAGCGTGATGTTGAACTC 203
##
＊＊
注：与正常组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01
APPL1 ATTTGTTCTTCGGACATCAAGC GTTTTTCTGATGCCCTACGATC 161
＊＊
##
AMPK CAACTATCGATCTTGCCAAAGG AACAGGAGAAGAGTCAAGTGAG 106 Note：vs. normal group， P＜0.01；vs. model group，P＜0.01
下游关键 IRS-1 TCATCTCCTCGGATGAGTATGG ACCCATGCAGATATAGTTGCTT 134 3.2 MGF对IR-HepG2细胞脂代谢的影响
因子 Akt TGACCATGAACGAGTTTGAGTA GAGGATCTTCATGGCGTAGTAG 110 与正常组比较，模型组细胞内 TG、TC 含量均显著
GLUT4 CTGAAGGATGAGAAGCGGAAG TCGAAGATGCTGGTCGAATAAT 167
内参 β-actin TGTCACCAACTGGGACGATA GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA 165 升高（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组细胞内上述指
2.7 细胞中AMPK蛋白磷酸化水平检测 标含量均显著降低（P＜0.01），详见表2。
采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 HepG2 3.3 MGF对IR-HepG2细胞AMPK信号通路上游关键
细胞适量，以1.2×10 个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下 因子mRNA表达的影响
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方法分组、造模、给药。各组细胞培养24 h后，弃去上清 与正常组比较，模型组细胞APN、AdipoR2、APPL1、
液，细胞用预冷的 RIPA 裂解液充分裂解，收集裂解液， AMPK mRNA 的相对表达量均显著降低（P＜0.05 或
于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min，取上清液并采用 P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和 MGF 低剂量
BCA 法测定蛋白浓度。根据蛋白浓度测定结果，加入 组 细胞 APN、AMPK mRNA 以及各药物组 AdipoR2、
5×SDS PAGE 蛋白上样缓冲液适量，于 100 ℃煮沸变性 APPL1 mRNA 的相对表达量均显著升高（P＜0.05 或
10 min。取变性蛋白，进行10％SDS-PAGE分离后，以湿 P＜0.01），详见表3。
转法转膜，经5％BSA室温封闭1 h；加入p-AMPK、AMPK 3.4 MGF对IR-HepG2细胞AMPK下游胰岛素信号通
一抗（稀释比例均为1∶1 000）和β-actin一抗（稀释比例为 路关键因子mRNA表达的影响
1 ∶ 2 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST溶液清洗10 min×3 与 正 常 组 比 较 ，模 型 组 细 胞 中 IRS-1、GLUT4
次，加入HRP标记的IgG二抗（稀释比例为1 ∶ 1 000），室 mRNA的相对表达量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；
温孵育1 h；用TBST溶液清洗10 min×3次，经ECL发光 与模型组比较，阳性对照组和 MGF 低剂量组细胞中

中国药房 2021年第32卷第9期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 9 ·1085 ·