Page 65 - 《中国药房》2021年8期
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min×2 次。擦拭掉非侵袭细胞后将小室放入烘箱中烘                         度（％）＝各实验组细胞每视野下平均荧光强度/空白对
        干，然后在倒置光学显微镜下观察各孔侵袭的细胞，每                           照组细胞每视野下平均荧光强度×100％。实验重复 3
        个小室随机选择5个视野进行拍照后进行计数，取其平                           次，数据处理同“2.2.1”项。
        均 值 作 为 检 测 结 果 。 实 验 重 复 3 次 ，数 据 处 理 同           2.6 ST 是 否 通 过 EGFR/PI3K/Akt 信 号 通 路 影 响
       “2.2.1”项。                                           SCL-1细胞生物学效应的研究
        2.5 ST对SCL-1细胞中EMT相关蛋白表达的影响                        2.6.1  加入 EGFR/PI3K/Akt 信号通路激动剂后对 ST 生
        2.5.1 Western blot 实验  将 SCL-1 细胞以 0.25％胰蛋         物学效应的影响         实验设置空白对照组（含0.1％DMSO
        白酶（含 EDTA）溶液消化 7 min 后，以 1 000 r/min 离心 5          的完全培养基）、ST 组（20 μmol/L）、ST+NSC228155
        min，收集细胞沉淀。按“2.2.2”项下方法将细胞重悬，                      组[20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155]和 ST+SC79
        然后按每孔 2 mL 将细胞接种至 6 孔板中，将其分为空                      组[20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79]，分别按“2.2.1”“2.3”
        白对照组（含 0.1％DMSO）和 ST 不同浓度组（5、10、20                “2.4”项下方法进行细胞培养并检测SCL-1细胞的增殖、
        μmol/L）。将细胞置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养，待                   迁移和侵袭能力。每个实验均重复 3 次，数据处理同
        培养24 h细胞贴壁后，每孔加入相应药液/完全培养基2                       “2.1.1”项。
        mL，继续培养 24 h；吸弃培养基，按每孔 100 μL 加入体                  2.6.2  细胞中 EGFR/PI3K/Akt 通路相关蛋白的表达
        积比1 ∶ 100的PMSF和RIPA裂解液的混合液，于冰上裂                      采用 Western blot法进行检测。按“2.7”项下方法对细
        解 15 min，然后在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 20 min，吸        胞进行分组、给药、电泳和转膜等操作。用5％脱脂牛奶
        取蛋白上清液，并采用BCA蛋白定量法进行蛋白定量。                          室温封闭 2 h 后，分别加入 EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、
        取变性后的蛋白20 μg行10％SDS-PAGE（电压85 V，时                  p-Akt、β-actin一抗（稀释比例均为1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过
        间 2 h），再以 320 mA 恒流 2 h 转至聚偏氟乙烯膜上。                 夜；TBST 溶液漂洗 15 min×3 次，加入 HRP 标记的山羊
        以 5％脱脂牛奶室温封闭 2 h 后，分别加入 E-cadherin、
                                                           抗兔 IgG 二抗（稀释比例为 1 ∶ 2 000），室温孵育 2 h；
        N-cadherin、β-actin一抗（稀释比例均为1 ∶ 1 000），4 ℃孵
                                                           TBST 溶液漂洗 15 min×3 次，加入 ECL 曝光液后，于凝
        育过夜；TBST 溶液漂洗 15 min×3 次，加入 HRP 标记的
                                                           胶成像仪中成像。以Image Lab 5.2.0软件测定目标条带
        山羊抗兔IgG二抗、HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗（稀释                       的灰度值，以目标蛋白与内参蛋白（EGFR以β-actin为内
        比例均为 1 ∶ 2 000），室温孵育 2 h；TBST 溶液漂洗 3 次×            参，p-PI3K 以 PI3K 为内参，p-Akt 以 Akt 为内参）的条带
        15 min，加入 ECL 曝光液后，于凝胶成像仪中成像。以                     灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。实验重复3次。
        Image Lab 5.2.0 软件测定目标条带的灰度值，以目标蛋                  2.7  ST的细胞毒性考察
        白与内参蛋白（β-actin）的条带灰度值比值表示目标蛋白
                                                               分别将 SCL-1、WS1 细胞分为空白对照组（含 0.1％
        的表达水平。实验重复3次。
                                                           DMSO的完全培养基）、ST组（20 μmol/L）、EGFR抑制剂
        2.5.2  免疫荧光实验        按“2.2.2”项下方法对 SCL-1 细
                                                           ZD1839 组（阳性对照，20 μmol/L）和 PI3K/Akt 抑制剂
        胞进行消化、离心和重悬，然后按每孔 100 μL 接种到预
        先放有盖玻片的 6 孔板中，并加入完全培养基 2 mL，吹                      LY294002组（阳性对照，20 μmol/L），按“2.2.1”项下方法
        打混匀。将细胞置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 24 h                    检测细胞的增殖能力，并进行数据处理。实验重复3次。
        后，以PBS清洗细胞爬片5 min×3次，然后将细胞分为空                      2.8  统计学方法
        白对照组（含 0.1％DMSO 的完全培养基）和 ST 不同浓                        采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
                                                           料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
        度组（5、10、20 μmol/L），每组设置3个复孔，各组细胞均
                                                           两两比较采用 LSD-t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计
        按每孔100 μL加入相应药液/完全培养基。将细胞再次
                                                           学意义。
        置于37 ℃、5％CO2的培养箱中培养24 h，然后用PBS浸
        洗 3 min×3 次，用 4％多聚甲醛溶液固定爬片 15 min，以                3 结果
        PBS浸洗5 min×3次，用0.3％TritonX-100试剂室温通透               3.1 ST对SCL-1细胞增殖的影响结果
        25 min，以PBS浸洗5 min×3次，将爬有细胞的盖玻片倒                   3.1.1 CCK-8 实验结果       与空白对照组比较，5、10、20
        扣在载玻片上，在每个盖玻片上滴山羊血清室温封闭                            μmol/L ST组细胞的增殖率均显著降低（P＜0.05），且ST
        30 min后，吸掉多余封闭液，分别加入N-cadherin、E-cad-              的作用具有明显的浓度依赖性（P＜0.05）。各组 SCL-1
        herin一抗（稀释比例均为1 ∶ 100），4 ℃孵育过夜；PBS浸                细胞增殖率的测定结果见表1。
        洗3 min×3次，避光加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、                     3.1.2 EDU 染色实验结果           与空白对照组比较，5、
        HRP 标记的山羊抗鼠 IgG 二抗（稀释比例均为 1 ∶ 100），                10、20 μmol/L ST 组的细胞阳性率均显著降低（P＜
        室温孵育 1 h；以 PBS 浸洗 3 min×3 次，用 DAPI 复染核 5           0.05），且 ST 的作用具有一定的浓度依赖性趋势，其中
        min；以PBS浸洗3 min×3次，吸水纸吸干多余液体，然后                    20 μmol/L ST组的细胞阳性率显著低于5、10 μmol/L ST
        用含荧光猝灭剂的封片液封片。在荧光显微镜下观察                            组（P＜0.05）。各组SCL-1细胞的EDU染色图见图1（图
        并采集图像，用Image Pro Plus 6.0软件测定各组细胞每                 中，EDU 表示阳性细胞，DAPI 表示细胞核，Merge 表示
        视野下的荧光强度并计算其相对荧光强度：相对荧光强                           两者的荧光合并图），阳性细胞率的测定结果见表1。


        中国药房    2021年第32卷第8期                                              China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 8  ·955 ·
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