Page 64 - 《中国药房》2021年8期
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钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）凝胶试剂盒、二喹啉甲                       2.2.2 EDU 染色实验       将 SCL-1 细胞用 0.25％胰蛋白
        酸（BCA）定 量 试 剂 盒（批 号 分 别 为 MA0388-08F、               酶（含 EDTA）溶液消化 8 min 后，以 1 000 r/min 离心 5
        MA0082-02C）均购自大连美仑生物技术有限公司；兔源                       min，吸弃上清液，收集细胞沉淀。将细胞沉淀用完全培
        EGFR、PI3K、磷 酸 化 PI3K（p-PI3K）、Akt、磷 酸 化 Akt          养基重悬，制成密度为 2×10 mL 的细胞悬液。在 6 孔
                                                                                        －1
                                                                                    5
        （p-Akt）多克隆抗体（批号分别为 25869、60225、10176、               板中铺上无菌盖玻片，并按每孔 200 μL 加入细胞悬液。
        12789、22018）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔源                      将细胞分为空白对照组（含0.1％DMSO的完全培养基）
        N-钙黏着蛋白（N-cadherin）多克隆抗体、鼠源 E-钙黏着                   和 ST 不同浓度组（5、10、20 μmol/L），每组设置 2 个复
        蛋白（E-cadherin）单克隆抗体、鼠源β-肌动蛋白（β-actin）               孔。每组细胞中加入EDU 溶液（按 RPMI 1640 培养基
        单 克 隆 抗 体（ 批 号 分 别 为 GB111009、GB12868、              和 EDU 原液体积比 1 000 ∶ 1 稀释）1.9 mL 和相应药液/
        GB12001）均购自武汉塞维尔生物技术有限公司；辣根                         完全培养基 100 μL，于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 2.5
        过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）                        h，根据 EDU 增殖检测试剂盒说明书方法对其进行洗
        二 抗 、HRP 标 记 的 山 羊 抗 鼠 IgG 二 抗（批 号 分 别 为            片、固定、染色、DAPI染核等操作。随后，在荧光显微镜
        AS014、AS003）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公                        下随机选取5个视野进行拍照，分别计数每视野下的阳
        司；5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EDU）增殖检测试剂盒                       性细胞数（即出现绿色荧光的细胞数），并计算阳性细胞
        （批号C0088L）购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL                       率：每视野下的阳性细胞率（％）＝每视野下阳性细胞数/
        高敏曝光液（批号36222ES60）购自武汉聚能慧达生物科                       总细胞数×100％，每组均取平均值作为检测结果。实验
        技有限公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，                            重复3次，数据处理同“2.2.1”项。
        水为超纯水。                                              2.3 ST对SCL-1细胞迁移能力的影响
        1.3  细胞                                                 采用细胞划痕实验进行检测。按“2.2.2”项下方法
            人皮肤鳞状细胞癌 SCL-1 细胞购自武汉普诺赛生                       对SCL-1细胞进行消化、离心和重悬。将细胞悬液按每
        物科技有限公司，人正常皮肤表皮纤维细胞WS1购自美                           孔 1 mL 接种至 6 孔板中，并按每孔 1 mL 加入完全培养
        国ATCC细胞库。                                           基，吹打混匀后，将细胞分为空白对照组（含0.1％DMSO
        2 方法                                                的完全培养基）和 ST 不同浓度组（5、10、20 μmol/L），每
        2.1  细胞的培养                                          组设置 3 个复孔。将细胞置于 37 ℃、5％CO2培养箱中
            将 SCL-1 细胞和 WS1 细胞分别用含 10％FBS 的                 培养过夜，待细胞融合度达95％以上时，用200 μL移液
        RPMI 1640培养基（后文简写为“完全培养基”）在37 ℃、                    枪枪头在每孔细胞中划3条线。以磷酸盐缓冲液（PBS）
        5％CO2 培养箱中进行培养，当细胞生长至融合度约                           洗涤2次后，分别加入RPMI 1640培养基1.9 mL和相应
        90％时，用 0.25％胰蛋白酶（含 EDTA）溶液对其进行消                     药液/完全培养基100 μL。在加药培养的0、24 h时，分别
        化、传代，取对数生长期且状态良好的细胞用于后续实                            在倒置光学显微镜下随机选取5个视野对进行拍照，使
        验（本研究所用的为传代6～10代的细胞）。                               用 Image Pro Plus 6.0 软件测量各孔划痕的面积并计算
        2.2  ST对SCL-1细胞增殖的影响                                各组细胞的相对迁移率：相对迁移率（％）＝（实验组培
        2.2.1 CCK-8 实验     将 SCL-1 细胞用 0.25％胰蛋白酶            养0 h时的划痕面积－实验组培养24 h时的划痕面积）/
        （含EDTA）溶液消化7 min后，以1 000 r/min离心5 min，             （空白对照组培养 0 h 的划痕面积－空白对照组培养 24
        吸弃上清液，收集细胞沉淀。将细胞沉淀用完全培养基                            h 时的划痕面积）×100％，每组均取平均值作为检测结
                               3
        重悬，制成密度均为 4×10 mL 的单细胞悬液，按每孔                        果。实验重复3次，数据处理同“2.2.1”项。
                                  －1
        100 μL 接种到 96 孔板中。将细胞分为空白对照组（含                      2.4  ST对SCL-1细胞侵袭能力的影响
        0.1％DMSO 的完全培养基，下同）和 ST 不同浓度组（5、                        采用Transwell小室侵袭实验进行检测。将Matrigel
        10、20 μmol/L，以完全培养基配制，药物浓度均根据前期                     胶和不含血清的培养基按体积比 1 ∶ 8 混匀，均匀铺在
        预实验结果确定，下同），每组设置6个复孔；并另设不加                          Transwell 小室的上室，在 37 ℃培养箱中将 Matrigel 烘
        细胞和药物的调零孔。将细胞置于 37 ℃、5％CO2培养                        干，弃掉多余的培养基。按“2.2.2”项下方法对SCL-1细
        箱中培养过夜，待细胞充分贴壁后，每孔加入相应药液                            胞进行消化、离心并收集细胞，然后将细胞用完全培养
                                                                                      －1
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        或完全培养基 100 μL。培养 24 h 后，吸弃培养基，按每                    基重悬，制成密度为4×10 mL 的细胞悬液。吸取上述
        孔100 μL加入CCK-8溶液（将CCK-8溶液与RPMI 1640                 细胞悬液100 μL到Transwell小室的上室，下室加入完全
        培养基按体积比1∶9混合）；作用3 h后，采用多功能酶标                        培养基700 μL。将细胞分为空白对照组（含0.1％DMSO
        仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD）值并计算各                        的完全培养基）和ST不同浓度组（5、10、20 μmol/L），每组
        组细胞的增殖率：增殖率（％）＝（实验组OD值－调零孔                          设置 3 个复孔。各组细胞均按每孔 100 μL 加入相应药
        OD值）/（空白对照组OD值－调零孔OD值）×100％。实                       液/完全培养基。将小室置于37 ℃、5％CO2培养箱中培
        验重复 3 次。去掉 3 次实验中的最大值和最小值，将其                        养过夜后，再以4％多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗
        余所有数据均用于统计分析。                                       5 min×2 次；用 1％结晶紫试剂染色 15 min，PBS 漂洗 5


        ·954 ·   China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 8                                   中国药房    2021年第32卷第8期
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