Page 48 - 《中国药房》2021年5期
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nwu.edu.cn/tcmsp.php），分别以“黄连”“黄芩”“黄柏”“栀             胞极化靶点-KEGG 通路”网络图，并选取基因数排名前
        子”为检索词，以口服生物利用度（OB）≥30％ 、类药性                        20 位 的 通 路 ，使 用 在 线 绘 图 OmicShare 工 具（http：//
                                               [10]
                   [11]
        （DL）≥0.18 为条件对活性成分进行筛选，并保存活性                        www.omicshare.com/tools/）绘制通路气泡图。
        成分的2D结构文件，再通过TCMSP平台找出各活性成                          2.6 细胞试验
        分对应的“Smile”号，保存为“SDF”格式文件（本文选择                          基于KEGG通路分析结果，笔者选择腺苷酸活化蛋
        有对应“Smile”号的活性成分进行后续研究）。                            白激酶（AMPK）信号通路中的 AMPK 蛋白进行细胞试
        2.2 黄连解毒汤中活性成分相关靶点的预测                               验，探讨黄连解毒汤是否通过作用于该通路调控巨噬细
            将“2.1”项下的“SDF”格式文件上传至 SwissTarget-              胞极化；同时，根据M1型巨噬细胞的极化因子有IL-1β、
        Prediction 数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）  iNOS，M2 型巨噬细胞极化因子有 IL-10、Fizz1，故亦选
        中，基于反向分子对接原理 ，进行靶点预测，获取黄连                           择上述极化相关因子进行mRNA表达的检测，以探讨黄
                                [12]
        解毒汤活性成分的预测靶点。                                       连解毒汤的抗炎作用机制研究。
        2.3  巨噬细胞极化相关靶点的获取及黄连解毒汤活性                          2.6.1  黄连解毒汤的制备         取黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6
        成分-巨噬细胞极化靶点网络的构建                                    g、栀子 9 g，加水 200 mL 煎煮 45 min，过滤，取续滤液加
            将“Macrophage polarization”作 为 检 索 词 ，通 过        热浓缩至 1 g/mL（以生药量计，下同），于 4 ℃保存。药
        Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//  液于大鼠灌胃前0.5 h加热，备用。
        omim.org/）数据库获取巨噬细胞极化的相关靶点；利用                       2.6.2  黄连解毒汤含药血清的制备              取 10 只大鼠适应
        Microsoft Excel 2019 软件将黄连解毒汤中活性成分的                 性喂养 3 天后，灌胃给予黄连解毒汤（10 g/kg，根据临床
        预测靶点与巨噬细胞极化相关靶点进行映射，获取黄连                            等效剂量换算而得），灌胃体积为1.5 mL，每天灌胃1次，
        解毒汤作用于巨噬细胞极化的靶点；然后将黄连解毒汤                            连续1周。末次给药2 h后，于大鼠股动脉取血，室温静
        的活性成分和上述靶点导入 Cytoscape 3.6.0 软件中，构                  置 4 h 后，以 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，即得黄
        建黄连解毒汤活性成分-巨噬细胞极化靶点网络图。                             连解毒汤含药血清，于－80 ℃保存，备用。
        2.4  PPI网格构建和核心靶点筛选                                 2.6.3  分组、造模及给药         将 RAW264.7 细胞接种于含
            将黄连解毒汤中活性成分的预测靶点导入String数                       10％胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中，于 37 ℃、5％
        据库（https：//string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，     CO2 条件下（下同）培养 48 h 后，以 1 000 r/min 离心 5
        获取所有蛋白-蛋白相关作用（PPI）关系，再导入 Cyto-                      min，弃上清液，沉淀中加入PBS和RPMI 1640培养基适
        scape 3.6.0 软件中，生成背景网络。在背景数据库选取                     量，制成密度为 1×10 个/mL 的细胞悬液。将细胞悬液
                                                                              6
       “2.3”项下映射得到的黄连解毒汤作用于巨噬细胞极化                           按100 μL/孔接种于96孔板中，并随机分为空白对照组、
        的靶点，并找到与其直接相连的节点，生成黄连解毒汤                            模 型 组 、辛 伐 他 汀 组（10 μ mol/L，剂 量 设 置 参 考 文
        活性成分调控巨噬细胞极化的 PPI 网络图。然后通过                          献[14－15]）和黄连解毒汤含药血清组，除空白对照组和
        Cytoscape 3.6.0软件“Tools”模块中的“Network analyzer-      模型组不加药液外（以等体积培养基代替），其余均加入
        network analysis-analyze network”选项进行网络分析，获         相应药液或含药血清100 μL，于37 ℃、5％CO2条件下恒
        取相关拓扑参数，以节点连接度（Degree）的 2 倍中位数                      温培养 2 h；然后除空白对照组外，其余各组均加入 100
        以及节点介度（Betweenness）和节点紧密度（Closeness）                μg/L 的 LPS 溶液（临用时用 RPMI 1640 培养基溶解配
        的中位数作为筛选依据 ，提取出核心靶点。                                制），培养24 h以诱导炎症。每组设置6个复孔。
                            [13]
        2.5 GO富集分析与KEGG通路分析                                 2.6.4  细胞中 AMPK 蛋白表达水平的检测              采用 Wes-
            利用Cytoscape 3.6.0软件中的“ClueGO”插件，选择              tern blot 法进行检测。取“2.6.3”项下各组给药、建模后
       “Biological Process（生物进程）”，对“2.4”项下所得的核              的细胞适量，加入蛋白裂解液裂解 0.5 h 后，于 4 ℃条件
        心靶点进行基因本体（GO）富集分析，以P＜0.05筛选显                        下以12 000 r/min离心10 min，取上清液，采用BCA试剂
        著富集的 GO。通过 DAVID 网站（http：//david.ncifcrf.           盒测定蛋白浓度。将蛋白变性后，取 50 μg 行 SDS-
        gov/）对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书                            PAGE 电泳，结束后转移至 PVDF 膜上，以 5％脱脂奶粉
        （KEGG）通路分析，以 P＜0.01 筛选显著富集的 KEGG                    室温封闭 2 h；加入 AMPK 抗体（稀释度为 1 ∶ 1 000）、
        通路，并按照核心靶点相关的基因数进行排序，结合文                            GAPDH抗体（稀释度为1 ∶ 500）孵育过夜；以PBST溶液
        献检索的方法，筛选出黄连解毒汤活性成分调控巨噬细                            清洗3次，加入二抗（稀释度为1∶200），于37 ℃条件下孵
        胞极化的可能通路和该通路上的相关靶点；再结合黄连                            育 1 h；以 PBST 溶液清洗 3 次，经 ECL 化学发光试剂盒
        解毒汤的活性成分，构建“黄连解毒汤活性成分-巨噬细                           显色后，置于凝胶成像仪上成像。采用 Image J v 1.5.1


        ·554 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5                                    中国药房    2021年第32卷第5期
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