Page 43 - 《中国药房》2021年5期

并于 37 ℃、5％CO2条件下培养 12 h 以复制 GCs 自噬模 表1 引物序列及扩增产物长度
型，再向模型组细胞中加入“2.2”项下生理盐水组大鼠血 Tab 1 Primer sequence and amplification product
清100 μL，向FSH组和苍附导痰丸各剂量组细胞中分别 length
加入“2.2”项下FSH注射组和苍附导痰丸各剂量灌胃组 基因 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度，bp
PI3K 上游：CAAAGCCGAGAACCTATTGC 226
的大鼠含药血清100 μL，每组设3个复孔。
下游：TTGAGGGAGTCATTGTGCTG
2.4 细胞上清液中E2、P含量的检测 Akt 上游：TGGACTACTTGCACTCCGAG 155
采用 ELISA 法进行检测。取“2.1”项下 GCs 悬液适 下游：CGCAGAACGTCTTCATGGTG
mTOR 上游：TGGCTTCTAAGTCTACCACGACAG 356
量，按“2.3”项下方法分组、造模和给药，置于 37 ℃、5％ 下游：GAGGTCCTGACATTCCCTGATT
CO2条件下培养 48 h。取各组细胞上清液适量，按照相 Beclin 1 上游：ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG 352
应 ELISA 试剂盒说明书方法操作后，采用酶标仪于 450 下游：GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG
LC3 上游：CGGAGCTTTGAACAAAGAGTGG 158
nm波长下检测各组细胞上清液中E2、P的含量。以上试 下游：CTCTCTCACTCTCGTACAC
验重复3次。 p62 上游：TCCCTGTCAAGCAGTATCC 147
下游：TCCTCCTTGGCTTTGTCTC
2.5 细胞中PI3K、Akt、mTOR蛋白相对表达量的检测
采用Western blot法检测。取“2.1”项下GCs悬液适 CO2条件下培养48 h。将细胞培养液以1 000 r/min离心
5 min后，弃上清液，取沉淀以2.5％戊二醛溶液于室温下
量，按“2.3”项下方法分组、造模和给药，置于 37 ℃、5％
固定 1 h 以上；以 PBS 漂洗后，加入 1％四氧化锇溶液于
CO2条件下培养48 h。在细胞中加入蛋白裂解液于碎冰
室温下固定1 h；再以50％、70％丙酮溶液各脱水1次后，
上裂解30 min，以12 000 r/min离心10 min后，收集上清
进行包埋、切片（厚度约 1 μm）及染色（3％醋酸铀-枸橼
液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，于沸水浴中变性
酸铅双染色），然后于透射电子显微镜下观察细胞中自
5 min。取变性后的蛋白样品，进行 SDS-PAGE 电泳、转
噬小体，并计数。
膜后，以 5％脱脂奶粉于室温下封闭 2 h；加入 PI3K 抗
2.8 统计学方法
体、Akt抗体、mTOR抗体（稀释度均为1 ∶ 1 000）孵育2 h
采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。计量资
后；以PBST清洗3次，加入二抗（稀释度为1 ∶ 200），室温
料以 x±s 表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，
孵育 2 h；以 PBST 清洗 13 次，使用化学发光试剂盒显色
组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计
后，置于凝胶成像系统上成像。采用 Image proplus 6.0
学意义。
软件进行分析，以目的蛋白与内参 GAPDH 的灰度值比
3 结果
值来表示目的蛋白的相对表达量。以上试验重复3次。
3.1 苍附导痰丸含药血清对细胞上清液中E2、P含量的
2.6 细胞中PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1、LC3ⅠⅠ、LC3ⅡⅡ、
影响
p62 mRNA相对表达量的检测
与空白对照组比较，模型组细胞上清液中E2含量显
采用实时荧光定量PCR法。取“2.1”项下GCs悬液
著降低（P＜0.01）；与模型组比较，FSH 组和苍附导痰丸
适量，按“2.3”项下方法分组、造模和给药，置于 37 ℃、
中、高剂量组细胞上清液中E2含量均显著升高（P＜0.05
5％CO2条件下培养 48 h。采用 TRIzol 法 分别提取各
[11]
或 P＜0.01）；各组细胞上清液中 P 含量差异均无统计学
组细胞中的总 RNA，采用紫外分光光度计于 260、280
意义（P＞0.05），详见表2。
nm 波长下检测 RNA 的纯度和浓度后，使用 cDNA 合成 表 2 各组细胞上清液中 E2、P 含量的测定结果（x±±s，
试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA，然后进行 PCR 扩增（引
n＝3）
物序列及扩增产物长度信息见表 1）。PCR 扩增体系 Tab 2 The contents of E2 and P in supernatant of cells
（20 μL）包括：cDNA 模板 4 μL、上/下游引物各 2 μL、无 in each group（x±±s，n＝3）
核酸酶水2 μL、荧光染料10 μL。PCR扩增条件为：94 ℃ 组别 E2，pg/mL P，ng/mL
预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 空白对照组 55.01±1.71 12.23±0.54
30 s，共 40 个循环。使用 Image J v1.5.1 软件分析结果， 模型组 31.55±1.16 ＊＊ 11.68±0.37
FSH组 50.73±1.27 ## 12.53±1.15
以GAPDH为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算PI3K、Akt、mTOR、 苍附导痰丸低剂量组 33.94±1.38 12.24±0.14
Beclin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62 mRNA的相对表达量。以 苍附导痰丸中剂量组 37.33±1.73 # 12.45±0.47
苍附导痰丸高剂量组 48.62±1.36 ## 12.46±0.26
上试验重复3次。
＊＊
##
注：与空白对照组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜
#
2.7 细胞中自噬小体的观察
0.01
采用透射电镜进行观察。取“2.1”项下 GCs 悬液适 Note：vs. blank control group， P＜0.01；vs. model group，P＜
＊ ＊
#
量按“2.3”项下方法分组、造模和给药，置于 37 ℃、5％ 0.05，P＜0.01
##
中国药房 2021年第32卷第5期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5 ·549 ·