Page 42 - 《中国药房》2021年5期
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卵泡发育障碍是多囊卵巢综合征、卵巢早衰、不孕                          胰蛋白酶、蛋白裂解液、2.5％戊二醛、磷酸盐缓冲液
        症等诸多妇科疾病的主要原因 。目前，上述疾病的西                           （PBS，pH 7.2）、山羊抗大鼠PI3K多克隆抗体、山羊抗大
                                   [1]
        医治疗手段以激素等药物为主，存在不良反应多、患者                            鼠Akt多克隆抗体、山羊抗大鼠mTOR多克隆抗体、山羊
        易复发等不足 ，故针对卵泡发育障碍相关疾病探讨更                            抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、TRIzol试剂、BCA试剂
                     [2]
        加有效、安全的治疗措施，具有重要的临床意义。近年                            盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）缓冲液、
        来，中药在卵泡发育障碍相关疾病方面的应用受到越来                            逆转录试剂盒（美国 Thermo Fisher Scientific 公司，批号
                  [3]
        越多的关注 。苍附导痰丸作为妇科常用方剂，可安全、                           分 别 为 00251450、00242682、00143679、01271398、
        有效地治疗多囊卵巢综合征、卵巢早衰等疾病，其机制                            03462477、05472588、04462976、05862874、15562672、
        可能与改善性激素[如雌二醇（E2 ）、孕激素（P）]水平、促                      14422598、06460571、02432319、01442466），PCR 引
                      [4]
        进卵泡发育有关 ，但具体机制尚未明确。                                 物[赛默飞世尔科技（中国）有限公司设计合成]，醋酸铀-
            研究表明，卵泡的发育与卵巢颗粒细胞（GCs）自噬                        枸橼酸铅双染色剂、PBST溶液（武汉博士德生物工程有
        的稳态平衡有关，而GCs的自噬受诸多细胞因子（如Be-                         限公司，批号分别为 BSD-GS88900、BSD-GS45907）；其
                                       [5]
        clin 1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62）的调控 。存在于卵母细胞                   余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯净水。
        中的磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是重要的细胞信号转导                        1.3 动物
        因子，其激活后的产物可促使蛋白激酶B（Akt）磷酸化，                             本研究所用动物包括 3 月龄雌性 SD 大鼠 30 只，体
        使其下游的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活化，从                          质量为（300±50）g，用于含药血清的制备；1 月龄雌性
                              [6]
        而影响 GCs 的增殖、凋亡 。PI3K/Akt/mTOR 通路是自                  SD 大鼠 15 只，体质量为（200±40）g，用于大鼠 GCs 的
        噬研究最广泛的信号通路之一，已有研究表明，激活该                            原代培养。实验动物均由广州中医药大学实验中心提
        通路可抑制 GCs 自噬，从而维持卵泡的正常发育及功                          供，动物生产许可证号为SCXK（粤）2018-0034。所有动
        能 [7－8] 。可见，通过 PI3K/Akt/mTOR 信号通路调节 GCs             物均饲养于温度（22±2）℃、相对湿度50％的动物房。
        自噬，有望成为治疗卵巢发育障碍疾病的新靶点。有鉴                            2 方法
        于此，本研究基于 PI3K/Akt/mTOR 通路和自噬相关因                     2.1  大鼠GCs的制备
        子，探讨苍附导痰丸调控大鼠 GCs 自噬的作用，以期为                             参考文献[9]方法，取1月龄的SD大鼠15只，处死后
        卵泡发育障碍相关疾病的治疗提供理论依据。                                取出卵巢，刺破卵巢上的成熟卵泡以收集卵泡液；将卵
        1 材料                                                泡液加入含青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）的
        1.1  主要仪器                                           DMEM/F12培养基中洗涤，以1 000 r/min离心5 min后，
            本研究所用主要仪器有：JEM-1000 型透射电子显                      弃上清，向沉淀中加适量DMEM/F12培养基，吹打混匀，
        微镜（日本 SanYo 公司）、BT25S 型万分之一电子天平                     制成细胞密度为1×10 个/mL的GCs悬液，备用。
                                                                              6
        （德国 Sartorius 公司）、Rotofix 32A 型离心机（德国 Het-          2.2  大鼠含药血清的制备
        tich 公司）、MK3 型酶标仪（美国 Bio-Rad 公司）、ECO 48                 参考文献[10]方法，取 3 月龄的 SD 大鼠 30 只，随机
        型 聚 合 酶 链 式 反 应（PCR）仪（英 国 PCRmax 公 司）、              分为生理盐水组（生理盐水，灌胃给药）、FSH 注射组
        BioDoc-IT型凝胶成像系统（美国UVP公司）、UV-6100S                 （10.71 IU/kg，皮下注射给药；剂量根据临床等效剂量换
        型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）、HH-501S                        算而得）和苍附导痰丸高、中、低剂量灌胃组[0.5、1、2
        水浴锅（上海赫田科学仪器有限公司）。                                  mg/g（按生药量计），灌胃给药；剂量分别为临床等效剂
        1.2 主要药品与试剂                                         量的5、10、20倍]，每组6只。各组大鼠每天皮下注射/灌
            本研究所用主要药品与试剂有：苍附导痰丸（由苍                          胃给药1次，连续3天。各组大鼠均在末次给药后，于腹
        术12 g、香附12 g、枳壳12 g、陈皮12 g、茯苓15 g、甘草6               主动脉采血，置于含有枸橼酸钠的离心管中，混匀后，以
        g组成，由广州中医药大学第一附属医院熬制而成，每袋                           3 000 r/min离心5 min，取上清液，于56 ℃水浴条件下灭
        200 mL，按生药量计质量浓度为 1 g/mL），卵巢刺激素                     活补体并用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，于－20 ℃下
        （FSH，美国 Invitrogen 公司），丙酸睾丸酮（TP）、DMEM/              保存，备用。
        F12 培养基、化学发光试剂盒、cDNA 合成试剂盒、甘油                       2.3 分组、造模和给药
        醛-3-硫酸脱氢酶（GAPDH）抗体以及 E2、P 酶联免疫吸                         取“2.1”项下 GCs 悬液适量，随机分为空白对照组、
        附法（ELISA）试剂盒（美国Life Technology公司，批号分                模型组、FSH组（阳性对照）和苍附导痰丸高、中、低剂量
        别 为 WP20147、 WP20489、 WP21138、 WP22467、             组，除空白对照组细胞加入“2.2”项下生理盐水组的大鼠
        WP20028、WP10267、WP71890），10％胎牛血清、0.25％              血清100 μL外，其余各组细胞均先加入TP（100 nmol/L）


        ·548 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5                                    中国药房    2021年第32卷第5期
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