Page 62 - 《中国药房》2021年第4期
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表 1 GAPDH、PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、PTEN 基因 2.4 细胞中 PI3KCA、Akt、mTOR、P-gp、PTEN mRNA
的引物序列及产物长度 表达水平的检测
Tab 1 Primer sequence and product length of GAPDH， 采用实时荧光定量PCR法进行检测。收集“2.2”项
PI3KCA，Akt，mTOR，P-gp and PTEN 下空白对照组、顺铂组、丹皮酚组和低、中、高浓度联用
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度，bp 组培养24 h的细胞，裂解后，按照Trizol法提取总RNA，
GAPDH 上游引物：GACCTGCCGTCTAGAAAAACC 229 逆转录成cDNA，反应条件：25 ℃反应5 min让引物充分
下游引物：GCTGTAGCCAAATTCGTTGTC
PI3KCA 上游引物：GTCAATCGGTGACTGTGTGG 233 退火结合到RNA模板上；50 ℃逆转录15 min；85 ℃灭活
下游引物：GACGATCTCCAATTCCCAAA 逆转录酶 5 min；4 ℃保持 10 min。将 cDNA 用无菌
Akt 上游引物：ACACCAGGTATTTTGATGAGGAG 143 ddH2O 做 8 倍稀释后进行 PCR 扩增，反应体系（20 μL）：
下游引物：TCAGGCCGTGCCGCTGGCCGAGTAG
mTOR 上游引物：GCAACCCTTCTTTGACAACATTTTT 297 cDNA（8倍稀释）4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，
下游引物：ATTTCTTCTCTCAGACGCTCTCC SYBR Green Master Mix 预混液 10 μL，50×ROX Refer-
P-gp 上游引物：ATAGGCTGGTTTGATGTGCAC 211 ence Dye2 预混液 0.4 μL，无菌 ddH2O 4.8 μL。反应条
下游引物：CAGCTGACAGTCCAAGAACAG 件：50 ℃预测保温2 min，95 ℃预变性10 min；95 ℃变性
PTEN 上游引物：CGACGGGAAGACAAGTTCAT 163
下游引物：AGGTTTCCTCTGGTCCTGGT 30 s，60 ℃退火延伸 30 s，共循环 40 次。采用 QuantStu-
1.3 细胞 dio TM Real-Time PCR Software v1.1 软件绘制溶解曲线，
人骨肉瘤细胞 MG-63 购自武汉普诺赛生命科技有 以 GAPDH 为 内 参 ，按 2 － Δ Δ Ct 法 计 算 PI3KCA、Akt、
限公司。 mTOR、P-Gp、PTEN mRNA 的表达水平，并以空白对照
2 方法 组为标准计算相对表达量。试验重复3次。
2.1 分组与给药 2.5 统计学方法
将对数生长期的MG-63细胞分为空白对照组、顺铂 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。数据以
组（4 µmol/L）、丹皮酚组（50 mg/L）和低、中、高浓度联用 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
组（50、100、200 mg/L 丹皮酚+4 µmol/L 顺铂）。空白对 比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
照组细胞仅加入完全培养基（即含10％胎牛血清、1％青 3 结果
链霉素双抗的 MEM 培养基，下同），其余组细胞加入含 3.1 丹皮酚与顺铂联用对MG-63细胞增殖率的影响
相应药物的完全培养基。本研究中顺铂和丹皮酚的给 与空白对照组比较，各药物组细胞各时间点的增殖
药浓度均参考文献[16－17]和前期预试验结果设置。 率均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。与顺铂组和丹皮
2.2 细胞增殖率的检测 酚组比较，低、中、高浓度联用组细胞各时间点的增殖率
采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期且生长状 （除低浓度联用组给药 24 h 外）均显著降低（P＜0.05 或
态良好的MG-63细胞，用完全培养基将细胞密度调整为 P＜0.01），详见表2。
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5×10 个/mL，按 100 µL/孔接种至 96 孔板中，于 37 ℃、 表 2 丹皮酚与顺铂联用对 MG-63 细胞不同时间点增
5％CO2 下培养过夜。将上述细胞按“2.1”项下方法分 殖率的影响（x±±s，n＝3，，％％）
组、给药，每组设置5个复孔，分别于37 ℃、5％CO2下培 Tab 2 Effects of paeonol combined with cisplatin on
养 24、48、72 h 时每孔加入 CCK-8 试剂 10 µL，培养 4 h。 the proliferation rate of MG-63 cells at different
使用酶标仪于 450 nm 波长处测定各孔的光密度（OD） time points（x±±s，n＝3，，％％）
值，计算细胞增殖率：细胞增殖率（％）＝给药组 OD 值/ 组别 24 h 48 h 72 h
空白对照组 100 100 100
空白对照组OD值×100％。试验重复3次。
顺铂组 74.72±5.51 ＊ 62.41±5.25 ＊ 39.83±5.03 ＊＊
2.3 细胞凋亡率的检测 丹皮酚组 73.94±5.46 ＊ 60.87±5.63 ＊ 39.04±5.22 ＊＊
采用 AnnexinⅤ-FITC/PI 双染法进行检测。收集 低浓度联用组 72.95±5.33 ＊ 51.12±4.41 ＊＊#Δ 35.92±4.44 ＊＊#Δ
“2.2”项下空白对照组、顺铂组、丹皮酚组和低、中、高浓 中浓度联用组 64.62±4.49 ＊＊#Δ 47.37±3.74 ＊＊#Δ 28.28±3.57 ＊＊##ΔΔ
高浓度联用组 56.63±3.71 ＊＊##ΔΔ 38.96±2.90 ＊＊##ΔΔ 24.62±3.01 ＊＊##ΔΔ
度 联 用 组 培 养 24 h 的 细 胞 ，用 不 含 乙 二 胺 四 乙 酸
注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01；与顺铂组比较，P＜
＊＊
＊
#
（EDTA）的 0.25％胰蛋白酶消化，以 1 500 r/min 离心 5
##
0.05，P＜0.01；与丹皮酚组比较，P＜0.05，P＜0.01
ΔΔ
Δ
min，弃去上清液，沉淀加磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2） Note：vs. blank control group， P＜0.05， P＜0.01；vs. cisplatin
＊
＊ ＊
重悬，并用PBS洗涤2次，再以1 500 r/min离心5 min，弃 group，P＜0.05，P＜0.01；vs. paeonol group，P＜0.05，P＜0.01
Δ
ΔΔ
##
#
去上清液，沉淀加入 Binding buffer 500 µL 重悬，分别加 3.2 丹皮酚与顺铂联用对MG-63细胞凋亡率的影响
入 Annexin Ⅴ-FITC 和 PI 染液各 5 µL，混匀后，于室温、 与空白对照组比较，各药物组细胞的凋亡率均显著
避光下反应 5～15 min，使用流式细胞仪检测各组细胞 升高（P＜0.01）。与顺铂组和丹皮酚组比较，低、中、高
凋亡情况。试验重复3次。 浓度联用组细胞的凋亡率均显著升高（P＜0.05 或 P＜
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