Page 38 - 《中国药房》2021年2期
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称取川乌、白附子、半夏、天南星、郁金和六神曲，置于研                          留时间的 RSD 为 0.49％～1.67％（n＝7），表明供试品溶
        钵中混匀，加入与上述药材总质量相等的牛胆汁搅拌均                            液于室温下放置12 h内稳定性良好。
        匀，置于密闭容器内，于 35 ℃、湿度 60％的恒温恒湿培                       2.3.6  重复性试验       取“2.2”项下化风丹药母发酵 1 周
        养箱中发酵4周，取出，干燥，即得化风丹药母。                              样品（编号 S3），约 3 g，共 6 份，按“2.3.2”项下方法制备
        2.2 化风丹药母发酵样品的制备                                    供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，以4号
            按化风丹药母处方比例称取川乌、白附子、半夏、天                         峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面
        南星、郁金和六神曲，共 12 份，按“2.1”项下方法制备发                      积。结果，8 个共有峰相对峰面积的 RSD 为 1.37％～
        酵 1 周样品（编号 S1～S12），用于指纹图谱的建立及含                      2.65％（n＝6），相对保留时间的 RSD 为 0.53％～1.64％
        量测定的方法学考察（前期预试验发现，无论发酵几周，                          （n＝6），表明方法重复性良好。
        所得样品均可用于指纹图谱的建立及含量测定的方法                             2.3.7 HPLC 指纹图谱的建立          取 12 批“2.2”项下化风
        学考察，故本研究选择发酵时间最短的样品）。另按化                            丹药母发酵 1 周样品（编号 S1～S12）适量，按“2.3.2”项
        风丹药母处方比例称取川乌、白附子、半夏、天南星、郁                           下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样
        金和六神曲，共15份，按“2.1”项下方法分别于发酵0、1、                      测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012
        2、3、4 周时取出，每周平行取出 3 份，置于－ 80 ℃冰箱                    版）》，以S1样品（随机选取）色谱图作为参照色谱，对照
        中保存，用于不同发酵时间样品的含量测定。                                指纹图谱采用中位数法，设定时间窗为 0～47 min，时间
        2.3 指纹图谱的建立                                         宽度为 0.3 min，经多点校正后自动匹配，采用平均值法
        2.3.1  色谱条件      以 Pntulips BP-C18 （250 mm×4.6 mm，  生成 HPLC 叠加指纹图谱和对照指纹图谱，详见图 1、
        5 μm）为色谱柱；以甲醇（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱                      图2。
        （0～24 min，100％B；24～48 min，100％B→80％B；48～
                                                              200
        55 min，80％B→100％B）；流速为0.8 mL/min，检测波长                           1
        为260 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。                            150
                                                                               4
        2.3.2  供试品溶液的制备          精密称取“2.2”项下化风丹              mV  100
        药母发酵 1 周样品（编号 S3），约 3 g，精密称定，置于具                     U，           2  3      5          6 7   8  R S12
                                                                                                       S10
                                                               50                                      S11
                                                                                                       S9
        塞锥形瓶中，加入水 20 mL，精密称定，超声（功率 100                                                                 S8
                                                                                                       S7
                                                                                                       S6
                                                                                                       S5
                                                                                                       S4
                                                                                                       S3
                                                                                                       S2
        W，频率53 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用水                       0                                       S1
                                                                 0       10      20      30       40      50
        补足减失的质量，以 20 000 r/min 离心 10 min，取上清                                         t，min
        液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。                           图1   12批化风丹药母发酵1周样品的HPLC 叠加指纹
        2.3.3  混合对照品溶液的制备            精密称定尿嘧啶、次黄                  图谱
        嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷对照品适量，加水                          Fig 1  HPLC superimposed fingerprints of 12 batches
        制 成 上 述 成 分 质 量 浓 度 分 别 为 0.174、0.151、0.152、              of Huafengdan yaomu after one week of fer-
        0.152、0.182、0.148、0.163 mg/mL 的 单 一 对 照 品 贮 备             mentation
        液。分别精密吸取上述单一对照品贮备液 0.5、1、4、1、                                 1
                                                              75             4
        1、1、1 mL，置于 10 mL 量瓶中，用水定容，混匀，制得尿                     mV  50
        嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷质量浓度                           U，  25     2  3   5         6 7  8
                                                               0
        分别为0.008 7、0.015 1、0.060 8、0.015 2、0.018 2、0.014 8、     0   5  10  15  20  25  30  35  40  45  50  55
        0.016 3 mg/mL的混合对照品溶液。                                                      t，min
                                                              图2 化风丹药母发酵1周样品的对照指纹图谱（R）
        2.3.4  精密度试验       取“2.3.2”项下供试品溶液（编号
                                                            Fig 2 Reference fingerprint of Huafengdan yaomu af-
        S3）适量，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以
                                                                  ter one week of fermentation（R）
        4 号峰为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰
        面积。结果，8 个共有峰相对峰面积的 RSD 为 1.65％～                     2.3.8  共有峰的指认        12 批化风丹药母发酵 1 周样品
        2.24％（n＝6），相对保留时间的 RSD 为 0.42％～1.73％                共有8个共有峰，通过与混合对照品溶液（图3 A）色谱峰
        （n＝6），表明方法精密度良好。                                    比对，共指认 7 个色谱峰，分别为尿嘧啶（1 号峰）、次黄
        2.3.5  稳定性试验       取“2.3.2”项下供试品溶液（编号               嘌呤（3号峰）、黄嘌呤（4号峰）、尿苷（5号峰）、肌苷（6号
        S3）适量，分别于室温下放置 0、1、2、4、6、8、12 h 时按                  峰）、鸟苷（7 号峰）、胸苷（8 号峰）。其中，4 号峰黄嘌呤
       “2.3.1”项下色谱条件进样测定，以4号峰为参照，记录各                        色谱峰保留时间适中，与其余色谱峰分离良好，故以其
        共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，8 个共有                           为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间和相对峰
        峰相对峰面积的 RSD 为 1.09％～2.85％（n＝7）、相对保                  面积，结果见表1、表2。


        ·160 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 2                                    中国药房    2021年第32卷第2期
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