Page 47 - 《中国药房》2021年第1期
P. 47

A14000011996，规格：2.2 g/丸）；二甲双胍片（中美上海                按2 g/kg（以葡萄糖量计）灌胃50％葡萄糖溶液。分别在
        施贵宝制药有限公司，批号：B14202013163，规格：0.5                   灌胃前（0 min）和灌胃后30、60、120 min时，于大鼠尾静
                                                                                       [21]
        g/片）；来曲唑片（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：                         脉取血，采用 GOP-POD 终点法 在全自动分析仪中测
        A14202157792，规格：2.5 mg/片）；羧甲基纤维素（CMC，              定大鼠的血糖水平。
        江苏奥福生物科技有限公司，批号：H19991223）；羊抗大                     2.4 大鼠体质量和血清中甾体激素水平检测
        鼠CYP19a1单克隆抗体、羊抗大鼠Glut4单克隆抗体、羊                         口服葡萄糖耐量实验结束24 h后，对所有大鼠禁食
        抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣                       不禁水 12 h，次日清晨测定其体质量，然后腹腔注射
        根过氧化物酶标记的羊抗大鼠免疫球蛋白 G（IgG）二                         10％水合氯醛将其麻醉，自眼眶后静脉丛取血。将血样
        抗、血糖测试纸以及大鼠促卵泡生成激素（FSH）、大鼠                         以 2 000 r/min 离心 10 min，分离血清，采用 ELISA 法检
        黄体生成素（LH）、大鼠睾酮（T）、大鼠雌二醇（E2）酶联                      测血清中 FSH、LH、E2、T 水平，具体操作严格按照相应
        免 疫 吸 附（ELISA）测 定 试 剂 盒（美 国 Thermo Fisher          试剂盒说明书进行。
        Scientific 公 司 ，批 号 ：22944764、20441354、22142129、   2.5 大鼠脏器质量测定和卵巢组织形态学观察
        23865472、23841657、23461810、23667503、23579014、          取血后，将大鼠以颈椎脱臼处死，剖腹取出并分离
        23248655）；Trizol试剂、ECL化学发光试剂盒、十二烷基                 子宫、双侧卵巢、性腺旁脂肪，清洗后称定质量并记录。
        硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、二喹                      取一半卵巢组织，用 10％中性福尔马林固定液固定、石
        啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（美国 Peprotech 公司，批                  蜡包埋，常规进行组织连续切片（厚度 10 μm），再脱蜡、
        号：021468、022324、002344、224677）；反转录试剂盒（日            水化后，行常规苏木精-伊红（HE）染色，以中性树胶封
        本Takara公司，批号：191334CC）；实时荧光定量-PCR试                 片，在显微镜下观察大鼠卵巢组织的形态学变化。余下
        剂盒（美国 AB-Clonal 公司，批号：A4376）；其余试剂均                 的组织置于－80 ℃冰箱中保存，待测。
        为分析纯或实验室常用规格，水为纯净水。                                2.6  大鼠卵巢组织中 CYP19a1 和子宫组织中 Glut4 的
        1.3  动物                                            mRNA表达水平检测
            55 只成年 SD 大鼠，SPF 级，10 周龄，雌性，体质量                    采用RT-PCR法进行检测。分别称取大鼠卵巢组织
        200～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供[动物                      和子宫组织各约100 mg，剪碎后，采用Trizol法提取组织
        生产合格证编号：SCXK（粤）2018-0034]。动物房温度                    总 RNA，并逆转录获得 cDNA。经鉴定后，以 cDNA 为
        为（22±2）℃、相对湿度为50％。本研究获得广州中医                        模板进行RT-PCR扩增。反应体系（共20 μL）：SYBR荧
        药大学动物伦理委员会的批准。                                     光染料10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 模板4 μL，无
        2 方法                                               核酸酶水 2 μL。反应条件：94 ℃变性 1 min，60 ℃退火
        2.1  造模                                            30 s，72 ℃延伸 1 min，重复 45 个循环。以 GAPDH 为内
            将55只大鼠先适应性饲养3 d，期间喂以颗粒饲料、                      参，采用 2   －ΔΔCt 法分析大鼠卵巢组织中 CYP19a1 和子宫
        自由饮水，并每日清晨行阴道分泌物涂片检查，选取动                           组织中Glut4的mRNA表达水平。引物序列及产物长度
        情周期规律的大鼠共50只进入正式实验。在50只入组                          见表1。
        大鼠中随机抽取10只作为空白对照组（n＝10），另外40                                    表1   引物序列及产物长度
        只作为造模组（n＝40）。造模组大鼠采用灌胃来曲唑[1                             Tab 1  Primer sequence and product length
        mg/（kg·d），以10 g/L CMC溶液制备药液]连续21 d来诱               基因名称              引物序列                  产物长度，bp
        导建立痰湿型 PCOS 模型，空白对照组同法大鼠灌胃等                        CYP19a1    上游：5′-GGGGAAAAATCCGCACACAC-3′  138
                                                  [18]
        量 10 g/L CMC 溶液，灌胃体积均为 4 mL/（kg·d） 。于                         下游：5′-AGTTTGCTGCCGAATCGAGA-3′
                                                           Glut4      上游：5′-AGGCACCCTCACTACCCTTT-3′  106
        造模第21天时，检查大鼠阴道分泌物涂片，若持续出现
                                                                      下游：5′-TTTCCTTCCCAACCATTGAG-3′
                                            [19]
        角化细胞、失去动情周期，则视为造模成功 。                              GAPDH      上游：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3′  78
        2.2 分组与给药                                                     下游：5′-CCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3′
            将造模成功的 40 只大鼠采用随机数字表法随机分                       2.7  大鼠卵巢组织中 CYP19a1 和子宫组织中 Glut4 的
        为模型组、二甲双胍组[阳性对照，0.135 g/（kg·d），相当                  蛋白表达水平检测
        于成人临床剂量] 和桂枝茯苓丸低、高剂量组[4.49、                            采用 Western blotting 法进行检测。分别取大鼠卵
                        [20]
                                                 [19]
        17.96 g/（kg·d），分别相当于成人剂量的 1、4 倍] ，每组               巢组织和子宫组织适量，加入裂解液使其充分裂解，然
        10 只。造模成功后的第 2 天各药物组大鼠开始灌胃给                        后以12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA法测
        药（药物以生理盐水配制成相应药液），每天1次，连续给                         定蛋白浓度。将蛋白煮沸 5 min 变性后，取 30 µg 进行
        药30 d；空白对照组和模型组大鼠同法灌胃等体积生理                         SDS-PAGE，然后以恒流（100 mA，2 h）电转至聚偏二氟
        盐水。                                                乙烯（PVDF）膜上；用5％脱脂奶粉于室温封闭1 h后，加
        2.3  口服葡萄糖耐量实验                                     入CYP19a1、Glut4、GAPDH一抗（稀释度均为1∶1 000），
            末次给药结束后，各组大鼠禁食不禁水 12 h，然后                      4 ℃孵育过夜；以TBST缓冲液洗膜3次，加入二抗（稀释


        中国药房    2021年第32卷第1期                                                China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 1  ·41 ·
   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52