Page 42 - 《中国药房》2021年第1期
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滤除菌，于－20 ℃保存，备用。                                    12 h时收集对照组、模型组和小续命汤高浓度组的大鼠
        2.2.2  分离培养星形胶质细胞            取新生 SD 大鼠 10 只，        星形胶质细胞接种至 6 孔板，悬浮于 DCFH-DA 稀释液
        于无菌条件下断头取脑，将脑组织放入 4 ℃预冷的                           （1 ∶ 1 000）中，在 37 ℃的细胞培养箱内孵育 20 min；以
        D-PBS 培养皿内并置于冰盒上，漂洗 3 次后转入 2 mL                     PBS洗涤3次，去除未进入细胞内的DCFH-DA 后，于荧
        4 ℃预冷的D-PBS液中。去除大鼠的脑膜及大血管，分                         光显微镜下观察并拍照。阴性对照采用 PBS 替代
        离其大脑皮质并剪成 1 mm 大小的碎块，加入 0.25％胰                      DCFH-DA，其余同法操作。采用Image Pro Plus 6.0软件
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        蛋白酶，于 37 ℃条件下消化 30 min，随后加入 DMEM/                   计算细胞的平均光密度用来表示细胞中ROS水平，该值
        F12完全培养基内终止消化；在4 ℃、1 000 r/min条件下                   越高，则ROS水平越高。试验重复3次。
        离心10 min，弃上清液，加入适量DNA酶消化至肉眼不                        2.5 大鼠星形胶质细胞中MnSOD水平的检测
        见胶丝状物，以乙二胺四乙酸（EDTA）终止消化；以                               采用免疫荧光双染法检测。于 OGD 2.5 h 后复氧
        4 ℃、1 000 r/min再次离心10 min，弃上清液，收集沉淀，                12 h时收集对照组、模型组和小续命汤高浓度组的大鼠
        加入适量 DMEM/F12 完全培养基，吹打成单细胞悬液，                       星形胶质细胞接种至6孔板，PBS洗涤3次，经40 g/L的
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                                               2
        调整细胞密度至 1.5×10 个/mL，接种于 75 cm 的培养瓶                  多聚甲醛固定 10 min；清洗后，用 3％正常羊血清封闭 1
        中。采用差速贴壁法 1 h 去除成纤维细胞后，将细胞悬                         h；加入 GFAP 一抗（1 ∶ 100）和 MnSOD 一抗（1 ∶ 100），于
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        液转移至新的 75 cm 培养瓶继续培养，每 3 天换液 1                      4 ℃下过夜孵育；PBS 洗涤后，加入 Cy3 标记的二抗
        次。培养 7 d 后，将培养瓶放入水平摇床（260 r/min，
                                                           （1 ∶ 500）和 FITC 标记的二抗（1 ∶ 500），室温避光孵育 2
        37 ℃）2 h，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱中平衡 1
                                                            h；PBS 洗涤后，加入 DAPI 染液（1 ∶ 100），室温避光孵育
        h，重新置于水平摇床（260 r/min，37 ℃）2 h，换液弃除少
                                                            30 min；PBS 充分洗涤后于荧光显微镜下观察并拍照。
        突胶质细胞；剩下的即为星形胶质细胞，再用 DMEM/
                                                            阴性对照采用 PBS 替代一抗，其余同法操作。采用
        F12 完 全 培 养 基 清 洗 2 次 ，加 入 0.25％ 胰 蛋 白 酶 与
                                                            Image Pro Plus 6.0软件计算细胞的平均光密度用来表示
        0.02％ EDTA混合液（1∶1）消化、传代。每3天换液1次，
                                                            细胞中 MnSOD 水平，该值越高，则 MnSOD 水平越高。
        取用稳定生长的第3代细胞用于试验。
                                                            试验重复3次。
        2.2.3  分组与给药处理         将“2.2.2”项下培养的大鼠星
                                                            2.6  统计学方法
        形胶质细胞接种至6孔板，随机分为对照组、模型组和小
                                                                采用 SPSS13.0 统计学软件进行分析。计量资料以
        续命汤低、中、高浓度组。模型组和小续命汤各含药血
                                                            x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比
        清组采用 OGD 法（参照文献[16]）模拟体内脑缺血损伤
                                                            较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
        以建立体外细胞损伤模型：将大鼠星形胶质细胞转移至
        含 5％ CO2、95％ N2 的特制缺氧箱内，并给予低糖（0.5                   3 结果
                                                            3.1  小续命汤含药血清对OGD后复氧不同时间的大鼠
        mmol/L）DMEM/F12 培养基，于 37 ℃培养 2.5 h，随后将
                                                            星形胶质细胞中LDH含量的影响
        其移出缺氧培养箱，转入含有0（即模型组不加药）和低、
                                                                OGD后复氧不同时间的对照组细胞中LDH含量始
        中、高浓度的小续命汤含药血清（2.5％、5％、10％，以含
                                                            终保持在较低水平；模型组细胞分别在OGD后复氧0～
        药血清在培养基中的体积分数计算）的DMEM/F12完全
        培养基内继续培养（即复氧）一定时间。对照组细胞不                            12 h时，其LDH含量从（110.99±17.06）U/L逐渐上升至
        作任何处理。小续命汤含药血清的给药浓度设置参考                            （436.64±55.29）U/L，均显著高于对照组（P＜0.05），表
        文献[17]。                                             明细胞损伤程度逐渐加重；与 OGD 后复氧相同时间点
        2.3 大鼠星形胶质细胞中LDH含量的检测                               的模型组比较，小续命汤含药血清低、中、高浓度组细胞
            采用比色法进行检测。分别于OGD 2.5 h后复氧0、                     中LDH含量均不同程度地降低，并表现出时间和剂量依
        3、6、12 h时取对照组、模型组和小续命汤低、中、高浓度                       赖趋势，其中小续命汤含药血清各浓度组细胞在 OGD
        组的大鼠星形胶质细胞上清液置于 96 孔板，根据 LDH                        后复氧6、12 h时其LDH含量均较模型组显著降低（P＜
        检测试剂盒说明书将空白孔、标准孔、测定孔、对照孔分                           0.05），详见表 1。根据上述结果，本研究选取小续命汤
        别加入相应工作液，在37 ℃下避光孵育，再采用全自动                          含药血清的高浓度组和复氧12 h进行后续研究。
        酶标仪检测450 nm波长处的光密度（OD）值。根据公式                        3.2  小续命汤含药血清对OGD损伤模型大鼠星形胶质
        计算 LDH 含量：LDH 含量（U/L）＝[（测定孔 OD 值－对                  细胞中ROS水平的影响
        照孔OD值）/（标准孔OD值－空白孔OD值）]×标准品浓                            对照组大鼠细胞中平均光密度为10.79±5.37；模型
        度（0.2 mmol/L）×1 000。细胞上清液中 LDH 含量越高，                组细胞中平均光密度为 44.94±10.29，显著高于对照组
        则表明OGD导致的细胞损伤程度越高。试验重复8次。                          （P＜0.05）；小续命汤含药血清高浓度组细胞中平均光
        2.4  大鼠星形胶质细胞中ROS水平的检测                              密度为 19.23±5.27，显著低于模型组（P＜0.05），详见
            采用荧光探针法进行检测。于 OGD 2.5 h 后复氧                     图1。


        ·36 ·   China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 1                                    中国药房    2021年第32卷第1期
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