Page 62 - 《中国药房》2020年22期
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mg/kg）药液 0.5 mL，同时 DEN+CUR 组和 DEN+HZC 组             析进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
        大鼠分别腹腔注射CUR或HZC（剂量为80 mg/kg）药液                      3 结果
        0.5 mL。生理盐水、DEN、CUR 和 HZC 均每周给药 2 次                 3.1 CUR和HZC对HepG2细胞增殖的抑制作用
        （给药间隔 2～3 d），12 周后停药；剂量均根据预实验结                          经不同浓度 CUR（2.5～80 μmol/L）处理后，细胞增
        果设置。                                                殖 抑 制 率 分 别 为（3.85 ± 0.88）％ 、（6.59 ± 0.39）％ 、
        2.5.2  大鼠一般情况观察及肝脏指数计算                  实验从给       （21.62±1.64）％、（44.36±2.27）％、（64.26±2.37）％、
        药起到第24周末时结束。给药期间观察大鼠的饮食、活                          （83.34±2.43）％；经相应浓度 HZC 处理后，细胞增殖抑
        动及死亡情况，并记录体质量。所有大鼠按照《中国实                            制率分别为（5.70±1.30）％、（18.28±1.25）％、（38.66±
        验动物学会学术道德规范实施细则》进行麻醉和处死                             1.98）％、（57.81±2.32）％、（74.25±2.40）％、（90.78±
        后，测定最终体质量，并计算其与实验开始时体质量的                            3.45）％。结果表明，随着 CUR 和 HZC 浓度的升高，其
        差值作为体质量增量；然后立即切除肝脏，测定肝质量，                           对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，且呈浓度依赖趋势，
        并计算肝脏指数[肝脏指数＝肝脏质量（g）/最终体质量                          详 见 图 2。 经 计 算 ，CUR 和 HZC 的 IC50 值 分 别 为
        （g）×100％]来间接反映肝肿瘤的生长情况。如果发生                        （25.43±2.86）、（15.84±0.97）μmol/L。两种药物对细胞
        大鼠死亡，则即刻进行称量、解剖，按实验结束计算其体                           的抑制率和 IC50比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），
        质量增量、肝脏指数，并进行后续指标检测。                                表明相同浓度的HZC比CUR对HepG2细胞具有更强的
        2.5.3  大鼠肝脏外观及肝癌发生情况观察                  肉眼观察        抑制作用。
        大鼠肝脏大体形态、结节大小，判断肝癌发生情况并计                               100                                       ＊
        算其发生率（由于大鼠肝癌多为弥散性癌结节，故根据                               90
                                                               80          CUR                     ＊
        文献规定以出现直径＞6 mm 的结节判断为发生肝                               70          HZC              ＊
                                                              ％  60
          [10]
        癌 ），同时对肝癌结节（直径＞6 mm）进行计数。                             抑制率，  50               ＊
        2.5.4  大鼠肝组织病理学观察及癌细胞分裂指数计算                            40
                                                               30
          将大鼠肝组织进行常规固定，石蜡包埋，切片（4 μm），                          20             ＊
                                                               10      ＊
        进行 HE 染色，置于显微镜下观察并寻找肝癌结节组织                              0
        中癌细胞的核分裂象。随机统计20个高倍视野（HPF，×                              0     2.5    5      10     20     40    80
                                                                                 药物浓度，μmol/L
        400 倍）中肝癌细胞核分裂总数，换算成平均每 10 个                           注：与相同浓度的CUR组比较，P＜0.05
                                                                                     ＊
                                                                                              ＊
        HPF 的核分裂数（个/10 HPF），作为大鼠肝癌细胞核分                         Note：vs. CUR group at the same concentration，P＜0.05
        裂指数。                                                图2   不同浓度CUR和HZC对HepG2细胞增殖抑制率
        2.5.4  大鼠肝组织 PCNA 指数测定           采用免疫组化法                 的影响
        检测。取大鼠肝组织石蜡切片，经脱蜡、脱水，消除内源                           Fig 2 Effects of different concentration of CUR and
        性过氧化物酶的活性后，在0.01％枸橼酸盐缓冲液中进                                 HZC on inhibition rate of HepG2 cell prolifera-
        行抗原热修复。修复完毕后，滴加 10％山羊血清封闭，                                 tion
        再加入 PCNA 一抗（稀释度为 1 ∶ 50），4 ℃孵育过夜；加                  3.2  CUR 和 HZC 对 HepG2 细胞周期分布和凋亡的
        入二抗（稀释度为 1 ∶ 200），室温下孵育 1 h；然后进行                    影响
        DAB显色、苏木精复染、脱水透明封片，置于显微镜下观                              与对照组比较，随着药物浓度的升高，各给药组G0/
        察并拍照。镜下可见，肝癌组织的PCNA阳性染色呈棕                           G1期细胞百分比均显著升高、S期和G2/M期细胞百分比
        黄色，定位于细胞核，呈现颗粒状或弥散性分布。PCNA                          均显著降低（P＜0.05），且相同药物的不同浓度组间比
        阳性表达强度由染色强度积分（阴性：0分；弱：1分；中：2                        较差异均有统计学意义（P＜0.05）；与相同浓度的 CUR
        分；强：3分）和阳性细胞百分比积分（0％：0分；≤25％：1                      组比较，相应 HZC 组 G0/G1期细胞百分比均显著升高、S
        分；＞25％～50％：2 分；＞50％：3 分）相加后表示，最高                    期细胞百分比均显著降低（P＜0.05）。这表明，CUR 和
        为6分；评分≥3分则表示细胞为PCNA表达阳性。在显                          HZC 均可将 HepG2 细胞阻滞在 G0/G1期，并呈浓度依赖
        微镜下对 10 个视野内 PCNA 阳性表达细胞及所有肿瘤                       性，且 HZC 阻滞细胞周期的能力强于 CUR。与对照组
        细胞进行计数，计算PCNA指数：PCNA指数＝PCNA阳                        比较，随着药物浓度的升高，各给药组细胞凋亡率均显
        性表达细胞数/肿瘤细胞总数×100％ 。                                著升高（P＜0.05），且相同药物的不同浓度组间比较差
                                       [11]
        2.6  统计学方法                                          异均有统计学意义（P＜0.05）；与相同浓度的 CUR 组比
            采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计数资                      较，相应 HZC 组细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）。这
        料以用率表示，采用卡方检验进行组间比较；计量资料                            表明，CUR和HZC均可诱导HepG2细胞发生凋亡，并呈
        以x±s表示，若满足正态分布且方差齐性则采用方差分                           浓度依赖性，且 HZC 诱导细胞凋亡的作用强于 CUR。


        ·2744 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22                                 中国药房    2020年第31卷第22期
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