Page 61 - 《中国药房》2020年22期
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购自美国 Sigma 公司；HZC 原料药（河北科技大学化学                     MTT试液20 μL，继续培养4 h。吸弃各孔MTT试液，加
        与制药工程学院刘守信教授合成并鉴定，纯度：＞                             入0.1％DMSO溶液100 µL，振荡10 min待充分溶解后，
        99.5％）；兔源增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、兔抗人磷                      采用酶标仪在 490 nm 波长处测定各孔光密度（OD）值，
        酸 化 蛋 白 酪 氨 酸 激 酶 2（p-JAK2）、磷 酸 化 STAT3            并计算细胞增殖抑制率：抑制率＝（1－给药组OD值/对
       （p-STAT3）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-xl、Bcl-2相关X蛋           照组OD值）×100％。以抑制率为纵坐标、药物浓度为横
        白（Bax）、细胞色素C（Cyt-c）、胱天蛋白酶9（Caspase-9）、             坐标绘制细胞增殖抑制曲线，并采用SPSS 13.0软件计算
        Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PAPR）、β-肌动蛋白                 CUR和HZC的半数抑制浓度（IC50 ）。上述试验重复3次。
       （β-actin）多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗                       2.3 CUR 和 HZC 对 HepG2 细胞周期和细胞凋亡的影
        兔 IgG 二抗（美国 Santa Cruz 公司，批号：sc-71858、sc-          响考察
        16566、sc-293059、sc-130307、sc-8392、sc-65532、sc-         采用流式细胞术检测。取对数生长期HepG2细胞，
        33371、sc-81663、sc-65496、sc-74470、sc-8432、sc-2025）；  常规消化后，按 5×10 个/孔接种于 6 孔板中，培养 24 h，
                                                                              5
        胎牛血清（美国Gibco公司）；山羊血清（上海碧云天生物                       将细胞随机分为不同浓度的CUR组或HZC组以及对照
        技术有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（英国 Abcam 公                     组，每组设 6 个复孔。各给药组分别加入相应 CUR 或
        司，批号：ab102536）；异硫氰酸荧光素标记的膜联素 V/                    HZC药液（终浓度均为10、20、40 μmol/L，浓度根据前期
        碘化丙啶（Annexin V/PI）细胞凋亡试剂盒（杭州联科生                    预试验结果设置），对照组均加入PBS，培养48 h。收集、
        物技术有限公司）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（上海                        洗涤细胞，先后加入 5 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的
        碧云天生物技术有限公司）；ECL发光检测试剂盒（美国                         PI染色试剂，混匀，在室温下避光反应15 min后，用流式
        Millipore公司）；二甲基亚砜（DMSO）等其余试剂均为分                   细胞仪分别检测细胞周期分布和凋亡情况。上述试验
        析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。                                  重复3次。
        1.3  细胞                                            2.4  CUR 和 HZC 对 HepG2 细胞中凋亡相关蛋白表达
            人肝癌 HepG2 细胞系购自中国科学院上海细胞生                      的影响
        物研究所。                                                  采用 Western blotting 法检测。按“2.3”项下方法取
        1.4  动物                                            HepG2细胞接种、培养，分为不同浓度的CUR组或HZC
            健康清洁级 SD 大鼠 120 只，雄性，4 周龄，体质量                  组以及对照组，每组设6个复孔。各给药组分别加入相
        100～110 g，由河北医科大学动物中心提供，动物生产许                      应 CUR 或 HZC 药液（终浓度均为 10、20、40 μmol/L，浓
        可证号：SCXK（冀）2018-003。大鼠在温度 23 ℃、相对                  度根据前期预试验结果设置），对照组加入DMEM培养
        湿度 55％、12 h 光/12 h 暗循环、垫料干燥清洁的通风室                  基，培养48 h。在各孔中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂
        中饲养，笼具等均经高压灭菌处理后使用；所有大鼠均                           解液冰浴裂解25 min，收集细胞，在4 ℃条件下以15 000
        自由摄取市售颗粒大鼠饲料与清洁饮用水，适应性饲养                           r/min 离心 25 min。取上清，采用 BCA 法进行总蛋白定
        1周后用于实验。                                           量。将蛋白变性处理后取适量，采用10％十二烷基硫酸
        2 方法                                               钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转膜，以5％
        2.1  细胞培养和药物溶液配制                                   脱 脂 奶 粉 封 闭 2 h 后 ，加 入 p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、
            将人肝癌HepG2细胞解冻、复苏并接种至含有10％                      Bcl-xl、Bax、Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3、PAPR、β-actin
        胎牛血清的 DMEM 培养基中，于 37 ℃、5％CO2培养箱                    抗体（稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；然后加入二
        中培养（以下细胞培养条件相同），约3 d传代1次，取对                        抗（稀释度为 1 ∶ 500），室温孵育 2 h，以 ECL 发光检测试
        数生长期的细胞进行后续试验。HZC 和 CUR 均以                         剂显色，在成像分析系统中采集图像。以β-actin 为内
        0.1％DMSO溶液为溶剂配制成适当浓度的药液，用于细                        参，采用Image J 5.0软件分析目标蛋白条带的相对灰度
        胞试验和动物实验；DEN以水为溶剂配制成适当浓度的                          值，用来表示相应蛋白的表达水平。上述试验重复3次。
        药液，用于动物实验。                                         2.5 CUR和HZC对肝癌模型大鼠的抑瘤作用考察
        2.2 CUR和HZC对HepG2细胞增殖的影响考察                         2.5.1  分组与给药       取大鼠 120 只，随机分为正常对照
            采用 MTT 法检测。取对数生长期的 HepG2 细胞，                   组（CON组，n＝10）、CUR对照组（CUR组，n＝10）、HZC
        按5×10 个/孔接种于96孔板中，培养过夜。将细胞随机                       对照组（HZC 组，n＝10）、肝癌模型组（DEN 组，n＝30）、
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        分为不同浓度的 CUR 或 HZC 组以及对照组，每组设 6                     CUR防护组（DEN+CUR组，n＝30）、HZC防护组（DEN+
        个复孔。各给药组分别加入不同浓度的CUR或HZC药                          HZC 组，n＝30）。CON 组大鼠腹腔注射生理盐水 0.5
        液（终浓度均为2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，浓度根据前              mL；CUR 组和 HZC 组大鼠分别腹腔注射 CUR 或 HZC
        期预试验结果设置），对照组加入磷酸盐缓冲液（PBS，                         （剂量为 80 mg/kg）药液 0.5 mL；DEN 组、DEN+CUR 组
        pH 7.4，下同），培养 48 h。然后向各孔中加入 5 mg/mL                和 DEN+HZC 组 大 鼠 均 腹 腔 注 射 DEN（剂 量 为 50


        中国药房    2020年第31卷第22期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22  ·2743 ·
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