Page 56 - 《中国药房》2020年22期

细胞按 1×10 个/孔接种于按“2.1.1”项下所制备的 24 孔 表1 引物序列及产物长度
4
凝胶包被培养板上，每孔含有 20％FBS 的 DMEM 培养 Tab 1 Primer sequence and product length
基600 μL，再按“2.1.2”项下方法模拟PAH环境，获得AS 基因 引物序列 产物长度，bp
细胞模型；待培养 12～24 h 至贴壁后，模型组细胞采用 CTGF 上游：5′-AAAAGTGCATCCGTACTCCCA-3′ 89
下游：5′-CCGTCGGTACATACTCCACAG-3′
同等体积溶剂（生理盐水）处理，尼可地尔低、中、高浓度 AREG 上游：5′-GAGCCGACTATGACTACTCAGA-3′ 100
组细胞分别采用 50、100、200 μmol/L 尼可地尔处理（根 下游：5′-TCACTTTCCGTCTTGTTTTGGG-3′
GAPDH 上游：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′ 81
据前期预试验结果，选择可抑制PASMCs生长且仍可进
下游：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′
行分子水平研究的尼可地尔浓度，以生理盐水为溶剂）；
至 PVDF 膜上，以 5％脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入 CT-
所有组别均于37 ℃、5％CO2培养箱中培养48 h。
GF、AREG、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），在4 ℃
2.3 细胞增殖能力检测
条件下封闭过夜；TBST 清洗 10 min×3 次，加入二抗（稀
采用CCK-8法检测。取“2.2”项下分组、处理、继续 释比例为 1 ∶ 1 000），室温孵育 2 h；TBST 清洗 10 min×3
培养48 h的细胞，弃去培养基，用PBS清洗后，每孔加入 次，ECL 显色后应用凝胶成像系统成像并采用 Image
CCK-8 试剂 10 μL，于 37 ℃、5％CO2培养箱中继续孵育 Lab 5.2.1 软件分析。以β-actin 作为内参，目标蛋白 CT-
40 min，使用酶标仪检测 450 nm 波长处的光密度（OD GF、AREG与内参条带的灰度值比值作为目标蛋白的表
值），OD值与增殖能力成正相关。试验重复3次。 达水平。试验重复3次。
2.4 细胞迁移能力检测 2.7 统计学方法

采用Transwell法检测。取“2.2”项下分组、处理、继 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计量资
续培养48 h的细胞，经消化后，用无血清的DMEM培养 料均以 x±s 表示，两组间比较采用 Student’s t 检验。
基重悬并稀释成1×10 个/mL的细胞悬液。于Transwell P＜0.05表示差异具有统计学意义。
5
小室上层加入细胞悬液200 μL，下层中加入含20％FBS 3 结果
的 DMEM 培养基 500 μL，于 37 ℃、5％CO2的培养箱中 3.1 尼可地尔对PASMCs增殖能力的影响
培养 24 h。取出小室，用 PBS 洗去培养基，结晶紫染色 与正常对照组比较，模型组细胞 OD 值显著升高
10 min，用PBS清洗3次，用棉签将上层接种侧的细胞擦 （P＜0.01），表明 PASMCs 增殖明显，提示 AS 模型细胞
除干净，于显微镜下随机选取5个视野，进行细胞计数。 建立成功。与模型组比较，尼可地尔低、中、高浓度组细
试验重复3次。 胞OD值均显著降低，且尼可地尔中、高浓度组显著低于
2.5 细胞中CTGF和AREG mRNA表达的检测 低浓度组，高浓度组显著低于中浓度组（P＜0.05 或 P＜
采用 qRT-PCR 法检测。取“2.2”项下分组、处理、继 0.01），提示尼可地尔可抑制 PASMCs 的增殖，且抑制能
续培养 48 h 的细胞，用 RNeasy Mini Kit 提取细胞总 力随浓度的增加而增强。各组细胞OD值的检测结果见
RNA，采用Super Script Ⅱ阴性逆转录酶合成cDNA。将 表2。
cDNA 和 CTGF、AREG 引物与 qRT-PCR 检测试剂盒中 表2 各组细胞OD值的检测结果（x±±s，n＝3）
的Master mix混合，应用实时PCR系统进行扩增。反应 Tab 2 Determination results of OD values of cells in
体系（共 15 mL）：Master mix（终浓度为 1×）7.5 mL，引 each group（x±±s，n＝3）
物混合物0.6 mL（终浓度为0.4 mmol/L，上、下游引物比 组别 给药浓度，μmol/L OD值
例为 1 ∶ 1），cDNA 模板 1.5 mL（不超过总体系 10％）， 正常对照组 1.46±0.05
模型组 1.85±0.02 ＊＊
ddH2O 5.4 mL；扩增条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性
尼可地尔低浓度组 50 1.68±0.04 ##
10 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 10 s，循环 40 次。以 尼可地尔中浓度组 100 1.58±0.03 ##Δ
GAPDH为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算CTGF、AREG mRNA 尼可地尔高浓度组 200 1.35±0.03 ##ΔΔ▲▲
##
＊＊
的表达量，再以模型组为参照，计算各指标表达水平。 注：与正常对照组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01；与尼
ΔΔ
Δ
可地尔低浓度组比较，P＜0.05， P＜0.01；与尼可地尔中浓度组比较，
试验重复3次。引物序列见表1。
▲▲ P＜0.01
2.6 细胞中CTGF和AREG蛋白表达的检测
Note：vs. normal control group， ＊ ＊ P＜0.01；vs. model group，
采用 Western blotting 法检测。取“2.2”项下分组、 ## P＜0.01；vs. nicorandil low concentration group， P＜0.05， P＜
Δ
Δ Δ
处理、继续培养 48 h 的细胞，用 RIPA 溶液裂解，4 ℃下 0.01；vs. nicorandil medium concentration group， P＜0.01
▲▲
14 000 r/min 离心 20 min，提取总蛋白，测定蛋白含量。 3.2 尼可地尔对PASMCs迁移能力的影响
总蛋白经沸水煮 5 min 变性后通过 SDS-PAGE 分离，转 与正常对照组比较，模型组每视野迁移细胞数显著
·2738 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22 中国药房 2020年第31卷第22期