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光，当自噬水平较高时红色荧光增强，两者合成后呈黄                           料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
        色荧光，黄色荧光强度值越大则表明细胞自噬水平越                            两两比较采用 LSD-t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计
        高。试验重复3次。                                          学意义。
        2.4 人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响考察                          3 结果
            采用 CCK-8 法进行测定。将小鼠脾淋巴细胞按 1×                    3.1 人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞自噬的影响
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        10 个/孔接种至96孔板中，按“2.3”项下方法进行细胞分                         与空白对照组比较，各给药组细胞的荧光强度（指
        组、给药。培养 48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，然               合成后的黄色荧光强度，下同）均显著增大（P＜0.05 或
        后培养2 h。另设不加药物和细胞的阴性对照组。采用                          P＜0.01），说明给药后细胞的自噬水平均显著升高，且
                                                     [15]
        酶标仪于 450 nm 波长下测定各孔的光密度（OD）值 ，                     人参根提取物的作用具有一定的浓度依赖趋势。各组
        并计算各组细胞的存活率[细胞存活率（％）＝（给药组                          细胞的 AO 染色显微图见图 1，荧光强度测定结果见
        OD 值－空白对照组 OD 值）/（阴性对照组 OD 值－空白                    表1。
        对照组OD值）×100％]。试验重复3次。                              3.2 人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
        2.5  人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞培养液中 IL-4、                          与空白对照组比较，阳性对照组和 125、500 μg/mL
        IL-6和TNF-α水平的影响考察                                  人参根提取物组细胞的 OD 值均显著升高（P＜0.05 或
            采用 ELISA 法进行测定。将小鼠脾淋巴细胞按 1×                    P＜0.01），其中 500 μg/mL 人参根提取物组细胞的存活
        10 个/孔接种至96孔板中，按“2.3”项下方法进行细胞分                     率达到了150.00％。由此可见，125～500 μg/mL人参根
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        组、给药。培养48 h后，以3 000 r/min离心10 min，收集               提取物可刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。各组细胞的OD
        各孔细胞培养上清液。参照相应试剂盒说明书方法操                            值和存活率测定结果见表2。
        作，检测细胞培养液中IL-4、IL-6和TNF-α水平。试验重                    3.3  人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4、IL-6和
        复3次。                                               TNF-α的影响
        2.6  人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞中自噬相关蛋白                             与空白对照组比较，各给药组细胞培养液中 IL-4、
        表达的影响考察                                            IL-6 和 TNF-α水平均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），表
            采用 Western blotting 法进行测定。将小鼠脾淋巴               明给药后可促进小鼠脾淋巴细胞分泌免疫因子 IL-4、
        细胞按 5×10 个/孔接种至 6 孔板中，将细胞分为空白对                     IL-6 和 TNF-α，且人参根提取物的作用具有一定的浓度
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        照组和不同质量浓度人参根提取物组（按“2.3”项下方法                        依赖趋势。各组细胞培养液中 IL-4、IL-6 和 TNF-α水平
        设置为 32、125、500 μg/mL，以冻干粉末计）。培养 48 h               测定结果见表3。
        后，以 1 000 r/min 离心 5 min，收集各孔细胞，用 PBS 洗            3.4  人参根提取物对细胞中自噬相关蛋白表达的影响
        涤 3 次，然后加入细胞裂解液充分裂解后，再采用 BCA                           与空白对照组比较，125、500 μg/mL 人参根提取物
        法测定蛋白浓度。将蛋白变性处理后，取 50 μg 在 80 V                    组细胞中LC3BⅡ/LC3BⅠ、p-AMPK/AMPK均显著升高
        电 压 下 行 十 二 烷 基 硫 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶              （P＜0.05 或 P＜0.01），p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 均
       （SDS-PAGE）电泳 90 min，然后以 200 mA 湿法转膜 80              显著降低（P＜0.01）；32、125、500 μg/mL 人参根提取物
        min至硝酸纤维素膜（NC）上。将膜放入含5％脱脂奶粉                        组 细 胞 中 Beclin-1 蛋 白 表 达 水 平 均 显 著 升 高（P＜
        的PBST缓冲液中室温封闭1 h后，加入LC3B、Beclin-1、                 0.01）。各组细胞中自噬相关蛋白表达的电泳图见图2，
        AKT、p-AKT、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、β-actin          蛋白表达水平测定结果见表4。
        一抗（稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；以PBST缓冲                   4 讨论
        液洗膜 3 次，然后加入二抗（稀释度为 1 ∶ 1 000），室温孵                     本课题组前期经过设置人参根提取物样品溶液的
        育1 h；以PBST缓冲液再次洗膜3次，然后在智能成像系                       系列质量浓度梯度，确定了其在 32～500 μg/mL 质量浓
        统中采用 ECL 化学发光液显色。采用 Image J 1.52a 软                度范围内对小鼠脾淋巴细胞无毒性，且能够提高细胞活
        件对蛋白条带进行灰度值分析，以目标蛋白条带灰度值                           性，并具有浓度依赖趋势。因此，本研究选用 32、125、
        与内参β-actin 条带灰度值的比值表示目标蛋白的表达                       500 μg/mL这3个质量浓度进行研究。脾淋巴细胞增殖
                                                                                                     [16]
        水 平 ，分 别 以 p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/           是反映机体细胞免疫与体液免疫最直接的指标 。本
        mTOR 比值表示 AKT、AMPK、mTOR 蛋白的磷酸化水                    研究结果显示，人参根提取物作用于小鼠脾淋巴细胞
        平，以LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值反映IC3BⅠ向LC3BⅡ转                    后，细胞增殖能力显著增强。这说明人参根提取物能促
        化的情况。试验重复3次。                                       进小鼠体外淋巴细胞增殖，具有增强细胞免疫功能的
        2.7  统计学方法                                         作用。
                                                                                                    [17]
            采用GraphPad Prism 5 软件进行数据处理。计量资                    淋巴细胞是适应性免疫应答中的关键部分 ，本研

        中国药房    2020年第31卷第21期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 21  ·2599 ·
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