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the phosphorylation of AMPK protein，and significantly reduced the phosphorylation level of AKT and mTOR proteins，with
statistical significance （P＜0.05 or P＜0.01）. CONCLUSIONS：Ginseng root extract can induce autophagy of mice splenic
lymphocytes，activate the activity of splenic lymphocytes，regulate the secretion of cytokine by activating AMPK and inhibiting the
activation of AKT which can inhibit the activity of mTOR，so as to exert immune enhancement effect.
KEYWORDS Ginseng root extract；Splenic lymphocytes；Autophagy；Cytokine；Immune enhancement effect

人参是五加科人参属植物人参 Panax ginseng C. A. 得生物科技有限公司，批号：BS90043、BS4006、BS6271、
Mey.的干燥根及根茎 。据《神农本草经》记载：“人参主 BS4010、BS1555、BS4706、AP0060）；兔抗微管相关蛋白
[1]
补五脏，安精神，定魂魄，除邪气，明目、开心、益智，久服 轻链β 3 （LC3B）、酵母 ATG6 同源物（Beclin-1）单克隆抗
轻身延年”。现代药理学研究表明，人参具有改善记忆 体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋
[2]
力、抗疲劳、抗衰老、抗病毒以及提高免疫力等功效，并 白 G（IgG）二抗（美国 CST 公司，批号：12741、3495、
且对非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫均有明显的调 7074P2）；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为
节作用 [3-9] 。自噬是细胞吞噬自身细胞质蛋白或细胞器 超纯水。
进入囊泡，与溶酶体形成自噬溶酶体并降解其包裹的内 1.3 动物
容物的过程，以此可更新细胞器并完成细胞的自身代 SPF 级 C57BL/6 小鼠 20 只，雄性，8 周龄，体质量
谢 。同时，自噬在淋巴细胞的活化过程中起着重要的 18～20 g，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司，生
[10]
[11]
作用 。多个研究指出，人参及其主要成分具有免疫调 产合格证号：SCXK（吉）2018-0007。本实验方案符合
[12]
节的作用 。然而，人参对脾淋巴细胞自噬及免疫调节 《吉林省实验动物管理办法》对动物伦理的要求。
方面的作用鲜有报道。鉴于此，本研究选用人参根提取 2 方法
物体外作用于小鼠脾淋巴细胞，探究其对脾淋巴细胞自 2.1 人参根提取物的制备
噬、增殖以及免疫因子分泌的影响，并初步探讨其可能 精密称取人参根50 g，粉碎，过筛（80目），加入10倍
的作用机制，为人参根提取物的深入研究和开发提供理 量水（mL/g，下同），40 ℃水浴超声（频率：40 kHz，功率：
论基础。 600 W）提取 2 h，将提取液以 3 500 r/min 离心 5 min 后，
1 材料 滤过，收集滤液并进行超滤浓缩。残渣加 10 倍量水，
1.1 仪器 80 ℃水浴提取 1.5 h，将提取液以 3 500 r/min 离心 5 min
Infinite 200 Pro型酶标仪（瑞士Tecan公司）；3111型 后，滤过，收集滤液并进行超滤浓缩。分别将2次浓缩液
CO2培养箱、iBright型智能成像系统FL1000（美国 Ther- 冻干，即得（人参根提取物收率为21.58％），其中有效成
mo Fisher Scientific 公司）；IX73 型荧光显微镜（日本 分含量为人参蛋白 7.32％、人参多糖 8.7％、人参皂苷
Olympus 公司）；1645050 型蛋白质凝胶电泳仪、Mini- 9.5％。
Protean 1658001型电泳槽（美国Bio-Rad公司）。 2.2 小鼠脾淋巴细胞的制备
[13]
1.2 药品与试剂 将小鼠处死，按文献方法 在无菌操作条件下取出
人参药材采购自吉林抚松（采摘时间为2018年9月 其脾组织并制备脾淋巴细胞悬液，用血球计数板进行细
20 日），由长春中医药大学药学院肖井雷副教授鉴定为 胞计数，备用。
五加科人参属植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥 2.3 人参根提取物对小鼠脾淋巴细胞自噬的影响考察
根；RPMI 1640 培养基（美国 Hyclone 公司）；胎牛血清 采用 AO 染色法进行测定。将小鼠脾淋巴细胞按
6
（美国Gibco公司）；刀豆蛋白A（美国Sigma公司，批号： 5×10 个/孔接种至6孔板中，将细胞分为空白对照组（空
C0412，纯度：95％）；CCK-8试剂盒（美国Boster公司，批 白培养基）、阳性对照组（刀豆蛋白A，5 μg/mL ）和不同
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号：AR1160-500）；白细胞介素 4（IL-4）、IL-6、肿瘤坏死 质量浓度人参根提取物组（32、125、500 μg/mL，以冻干
因子α（TNF-α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海优选 粉末计，质量浓度按照前期预试验设置）。各组细胞加
生物科技有限公司，批号：YX-091204M、YX-091026M、 入相应药物在 37 ℃、5％CO2 培养箱中（下同）培养 48
YX-201606M）；红细胞裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白 h。以 1 000 r/min 离心 5 min，收集各孔细胞，以磷酸盐
浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号： 缓冲液（PBS）洗涤 3 次后，以 4％多聚甲醛室温固定 10
C3702、P0010）；吖啶橙（AO）染料（北京索莱宝科技有限 min，然后以 1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞；再次用
公司）；兔抗蛋白激酶 B（AKT）、磷酸化 AKT（p-AKT）、 PBS 洗涤 3 次，然后加入 AO 染液（终质量浓度为 15
腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶（AMPK）、磷 酸 化 AMPK μg/mL），室温避光孵育 15 min 后，在荧光显微镜下观察
（p-AMPK）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化 mTOR 细胞的形态并拍照。采用 Image Pro Plus 6.0 软件进行
（p-mTOR）、β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（南京巴傲 免疫荧光分析。当自噬水平较低时主要观察到绿色荧

·2598 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 21 中国药房 2020年第31卷第21期