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案得到了辽宁中医药大学实验动物福利伦理委员会                              铁苏木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s，
        批准。                                                 流水洗 3 min；Masson 蓝化液返蓝 3～5 min，流水洗 3
        2 方法                                                min；水洗 1 min，丽春红酸性品红染色液染色 5～10
        2.1 造模                                              min；弱酸工作液洗1 min，磷钼酸溶液洗1～2 min，弱酸
            采用切除 5/6 肾联合低蛋白饮食法建立 CKD-PEW                    工作液洗1 min，放入苯胺蓝染色液中染色1～2 min；弱
        模型。利用 3.5％水合氯醛麻醉小鼠后，将其背部左侧                          酸工作液洗1 min，95％乙醇快速脱水，无水乙醇分别脱
        毛发剃除，用碘伏进行消毒处理。用干净纱布将剃毛处                            水10 s×3次，二甲苯透明5 min×3次，中性树胶封片。将
        四周遮住，露出手术区域，并用剪刀剪开一个小口，逐层                           切片置于倒置显微镜下观察，并利用 Image pro plus 6.0
        剥离，暴露肾脏，挤出左侧肾脏并剥离肾脏两极组织，分                           软件计算TA横截面积。
        离肾蒂周围及结缔组织，完全游离左肾；从上至肾门约                            2.5 TA蛋白合成代谢能力检测
        0.4 cm、下至肾门约0.4 cm预置缝合线，勒紧缝合线并切                         将新鲜的TA置于DMEM培养基（5 mL）中，37 ℃下
                                                                                                14+
        除两极肾脏组织；7 d后暴露右侧肾脏，止血钳夹紧肾门                          充氧孵育30 min，然后在含放射性同位素 C-苯丙氨酸
        处并紧靠血管夹下方放置缝合线，在血管夹上方切除肾                            的 DMEM 培养基中继续孵育 1 h，磷酸盐缓冲液（PBS）
        脏，缝合并消毒手术切口，以复制CKD模型。假手术组                           洗5 min×3次，随后制备50％ TA匀浆液，加入10％三氨
        小鼠同期进行手术，仅剥离肾包膜，不切除肾组织。术                            乙 酸（TCA）沉 淀 蛋 白 质 ；吸 弃 上 清 ，加 入 0.5 mol/L
        后，用棉签压迫法止血，缝合伤口并涂上碘伏消毒，将小                           NaOH 溶液溶解沉淀的蛋白。取 1.8 mL 该蛋白溶液加
        鼠放入鼠笼饲养。手术 1 周后对 CKD 造模小鼠分别给                        入闪烁液进行液闪计数，取 0.2 mL 该蛋白溶液利用
        予 4％酪蛋白饮食饲养至实验结束，以建立 CKD-PEW                        BCA 试剂盒进行蛋白浓度检测，检测单位时间内（1 h）
                                                                  14+
        模型；假手术组给予正常饮食。通过比较各组小鼠体质                            掺入的 C-苯丙氨酸的放射性含量，分析蛋白合成代谢
                                                                [8]
        量、肌酐、尿素氮、白蛋白及24 h尿蛋白水平判断模型制                         能力 。
                  [8]
        备是否成功 。                                             2.6  TA蛋白分解代谢能力检测
        2.2  分组与给药                                              将新鲜的TA置于KRB缓冲液中，37 ℃下充氧孵育
            将 80 只小鼠分为假手术组（n＝10）和造模组（n＝                     2 h，取该孵育液用 10％TCA 沉淀，取上清 0.5 mL 与 1.0
        70），分 别 按 照“2.1”项 下 方 法 进 行 假 手 术 或 者               mL 5％TCA 混合均匀，依次加入 0.75 mL 硝酸、0.75 mL
        CKD-PEW造模。将造模成功的50只小鼠随机分为模型                         一氧化二氮，混合均匀，55 ℃下孵育30 min；随后加入2
        组，四君子汤低、中、高剂量组[2.34、4.68、9.36 g/（kg·d），             mL 双氯乙烯萃取，吸取上清液 200 μL 至 96 孔板中，利
        以生药量计；根据成人（60 kg）临床等效剂量的1、2、4倍                      用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度值，根据前期绘制
        换算]和复方α-酮酸片组[阳性对照，1 g/（kg·d）；根据成                    的标准曲线[以不同浓度（0～1 nmol/L）酪氨酸为横坐
        人（60 kg）临床等效剂量换算]，每组10只。小鼠灌胃给                       标、吸光度值为纵坐标]，计算TA蛋白分解代谢能力 。
                                                                                                        [8]
        药，每天给药 1 次，连续给药 14 d；假手术组和模型组小                      2.7  TA中凋亡相关基因mRNA表达检测
        鼠同法灌胃等体积生理盐水。                                           采用实时荧光定量-PCR 法检测 TA 中 Bax、Bcl-2、
        2.3  样本采集及处理                                        Caspase-3 mRNA 表达水平。采用 Trizol 法提取小鼠 TA
            在末次给药 1 h 后，称定小鼠体质量；然后利用                        中总 RNA，根据逆转录试剂盒说明书操作合成 cDNA，
        3.5％水合氯醛麻醉小鼠后，剪开小鼠皮肤，迅速分离出                          然后以 cDNA 为模板采用两步法进行 PCR 扩增。反应
        完整的左侧胫骨前肌（Tibialis anterior，TA），称量并记录               体系（共 20 μL）：cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）
        TA湿质量。将一半TA样本量（n＝5）用4％多聚甲醛固                         各 0.4 μL，2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O
        定，用于测量TA横截面积。另一半TA样本量（n＝5）取                         7.2 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 10 s，
        部分新鲜组织立即用于蛋白合成和分解代谢检测；剩余                            55 ℃退火 30 s，共 40 个循环。以β-actin 为内参，采用
        组织置于－80 ℃冰箱中保存，用于凋亡相关基因mRNA                         2 －ΔΔCt 法测定目的基因 mRNA 的表达水平（式中 Ct 表示
        表达和 Atrogin-1、MuRF-1 及 ROCK1/PTEN/Akt 信号通           目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数），并计算
        路相关蛋白表达的检测。                                         Bax、Bcl-2 mRNA表达水平的比值（Bax/Bcl-2）。引物序
        2.4 TA横截面积测定                                        列及扩增产物长度见表1。
            取出 4％多聚甲醛固定的 TA，流水冲洗数小时后，                       2.8 TA 中 Atrogin-1、MuRF-1 及 ROCK1/PTEN/Akt
        分别经 70％、80％、90％、100％乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ                     信号通路相关蛋白表达的检测
        各透明 15 min，再放入石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别浸蜡 60                           采用 Western blotting 法进行检测。利用总蛋白提
        min，并进行连续切片（5 μm）。切片脱蜡水化，Weigert                    取试剂盒提取小鼠TA中总蛋白，根据BCA试剂盒测定


        ·2360 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19                                 中国药房    2020年第31卷第19期
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