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性炎性痛模型，重点研究8-OaS对慢性炎性痛模型大鼠                         g 的 Von Frey 细丝垂直检测各组大鼠足底疼痛阈值，若
        脊髓背角内小胶质细胞激活的抑制作用，以及对磷酸化                           出现缩足、舔足、抬足等行为，则表明该Von Frey细丝对
        p38 MAPK（p-p38 MAPK）和相关炎症因子表达的影响，                  应规格为此时大鼠足底疼痛阈值。获取大鼠疼痛阈值
        以期明确8-OaS对慢性炎性痛的镇痛作用机制，并为其                         数据后，剔除疼痛阈值异常（疼痛阈值过高或过低）的大
        治疗慢性炎性痛提供实验依据。                                     鼠后分成两批，第一批分为假手术组（生理盐水）、模型
        1 材料                                               组（生理盐水）和8-OaS低、中、高剂量组（3、10、30 μg/kg，
        1.1 仪器                                             给药剂量参考本课题组前期研究 ，临用时用生理盐水
                                                                                        [7]
            CM1950 型冷冻切片机（德国 Leica 公司）；TL36-               配制成药液），每组 6 只，进行疼痛阈值检测，并计算
        TYZD型摇床（北京中西远大科技有限公司）；Microfuge                    8-OaS的半数有效剂量（ED50 ）值。第二批分为假手术组
        20R 型低温离心机（美国 Beckman 公司）；BX-60 型共聚                （生理盐水）、模型组（生理盐水）、8-OaS 组（给药剂量为
        焦激光显微镜（日本Olympus株式会社）；Tissuelyser-192              ED50 ），每组12只，并采用免疫荧光组织染色法和Western
        型组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；Chemi-                        blotting法进行后续试验。
        Doc TM  MP System 全能型成像系统（美国Bio-Rad公司）；                除假手术组大鼠同法注射等体积的生理盐水外，其
        Von-Frey细丝（上海玉研科学仪器有限公司）。                          余各组大鼠左侧足底注射 50 μL 弗氏完全佐剂，复制慢
        1.2 药品与试剂                                          性炎性痛模型大鼠。造模成功后将大鼠进行鞘内置管：
            8-OaS（批号：766720，纯度：≥97％）、弗氏完全佐剂                先腹腔注射 7％水合氯醛（0.4 mL/kg）麻醉，然后置于动
       （批号：344289）、小鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号：                物手术台上，取L2～S1节段备皮消毒；然后沿后背正中
        A1978）均购自美国 Sigma 公司；小鼠抗 Iba-1 单克隆抗                线垂直切开皮肤，依次分离筋膜和肌肉，暴露L5脊椎和
        体（批号：ab15690）、兔抗 TNF-α多克隆抗体（批号：                    L4、L5 脊椎间隙，首尾牵拉暴露硬脊膜，采用消毒玻璃
        ab92324）均购自美国Abcam公司；兔抗p38 MAPK单克                  细针于硬脊膜处开一点状入口，取预先注入 2％利多卡
        隆抗体（批号：4511s）、兔抗p-p38 MAPK单克隆抗体（批                  因的 PE 管置入硬脊膜，并停止牵拉 L4 和 L5 脊椎，将多
        号：8690s）均购自美国 Cell Signaling Technology 公司；        余的 PE 管沿皮下从项部穿出并固定，再以红霉素软膏
        小鼠抗IL-6多克隆抗体（批号：sc-57315）、小鼠抗IL-β多                 均匀涂抹伤口，待大鼠恢复正常活动时，向PE管内注入
        克隆抗体（批号：sc-12742）均购自美国 Santa Cruz 生物               10 μL生理盐水或8-OaS药液，管口外端用火封闭，当大
                                                                                                  [5]
        科技有限公司；Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠免疫球                   鼠双下肢行动不便时则证明 PE 管置管成功 。每日向
                               ®
        蛋白G（IgG）（批号：211-165-109）、Alexa Fluor 488标记         大鼠鞘内 PE 管内注入 10 μL 生理盐水或 8-OaS 药液 1
                                               ®
        的驴抗兔 IgG（批号：211-545-109）均购自美国 Jackson              次，连续给药7 d。
        Immuno-Research 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的                 2.2  大鼠足底疼痛阈值检测
        驴抗小鼠IgG（批号：ZDR-5307）、HRP标记的驴抗兔IgG                      将“2.1”项下第一批大鼠于给药后连续检测 7 d，每
       （批号：ZDR-5308）均购自北京中杉金桥生物技术有限                        天于同一时间进行检测；若大鼠用 15.0 g 或 26.0 g Von
        公司；10％ 十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶                        Frey 细丝检测时，其行为仍未改变，则停止检测。记录
       （PAGE）（美国Bio-Rad公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美                  各组大鼠足底疼痛阈值，并用 GraphPad Prism 5 软件对
        国Millipore公司）；组织裂解液（北京百奥莱博科技有限                     数据进行统计学分析，数据以 x±s 表示，多组间比较采
        公司）；ECL 化学发光液（北京拜尔迪诊断技术有限公                         用单因素方差分析，组间两两比较采用 t 检验，P＜0.05
        司）；其他试剂均为实验室常用试剂；水为纯净水。                            表示差异有统计学意义；采用量效曲线计算各组大鼠足
        1.3 动物                                             底疼痛阈值曲线下面积和8-OaS的ED50。各组大鼠足底
            健康的雄性SD大鼠，体质量200～220 g，购自空军                    疼痛阈值测定结果见表 1，各组大鼠疼痛阈值曲线下面
        军医大学动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK                         积测定结果见图1。
       （军）2019-001。所有大鼠均饲养于 22～25 ℃的恒温环                        由表1和图1可知，与假手术组比较，模型组大鼠足
        境中，白昼黑夜更替，正常饮食饮水。本实验在空军军                           底疼痛阈值和曲线下面积均显著降低（P＜0.01）；与模
        医大学动物研究伦理委员会批准下进行。                                 型组比较，8-OaS低剂量组大鼠在给药5、6、7 d后足底疼
        2 方法与结果                                            痛阈值显著升高（P＜0.05或P＜0.01），8-OaS中、高剂量
        2.1  分组、造模与给药                                      组大鼠在给药 1～7 d 后足底疼痛阈值和曲线下面积均
                            [5]
            参考相关文献方法 ，将所有大鼠置于行为检测室                         显著升高（P＜0.01）；与 8-OaS 低剂量组比较，8-OaS 中、
        适应 15 min 后，再置于镂空的行为检测钢丝网上适应 5                     高剂量组大鼠在给药 2～7 d 后足底疼痛阈值和曲线下
        min，然后序贯采用 1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0      面积均显著降低（P＜0.01）；与 8-OaS 中剂量组比较，


        中国药房    2020年第31卷第13期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 13  ·1585  ·
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