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2.2 大鼠血清中IL-1β、IL-6 水平检测                           灰度值，以目标蛋白条带与内参 GAPDH 蛋白条带的灰
            末次给药后 2 h，以 10％水合氯醛腹腔内注射麻醉                     度值的比值表示目标蛋白的表达水平。
        大鼠后，于腹主动脉取血。血样在3 000 r/min条件下离                     2.6 统计学方法
        心10 min，收集血清，按照ELISA试剂盒说明书操作，对                         实验数据采用SPSS 23.0软件进行统计分析。首先
        血清中IL-1β、IL-6 的水平进行检测。                             对数据进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以
        2.3 大鼠胃黏膜组织病理学观察                                   x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
            取血后迅速剖腹取出大鼠的全胃，沿胃大弯部剪                          比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        开，暴露胃腔，用生理盐水对胃腔进行清洗，然后沿胃小                          3 结果
        弯取出前后胃窦部胃黏膜处大小约 5 mm×10 mm 的组                      3.1 大鼠血清中IL-1β、IL-6水平测定结果
        织。取其中一部分胃黏膜组织，用 10％中性甲醛固定，                             与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6水平
        进行常规脱水、包埋和切片（4 µm）后，行苏木精-伊红                        显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和止痛
       （HE）染色，采用光学显微镜观察大鼠胃黏膜组织病理                           顺气胶囊中、高剂量组大鼠血清中 IL-1β水平和各给药
        学变化。                                               组大鼠血清中 IL-6 水平均显著降低（P＜0.05）；与阳性
        2.4  大鼠胃黏膜组织中 JAK1、STAT3、SOCS-3、c-Myc              对照组比较，止痛顺气胶囊各剂量组大鼠血清中IL-1β、
        mRNA表达水平检测                                         IL-6 水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠血
            采用实时荧光定量-PCR法。取大鼠胃黏膜组织适                        清中IL-1β、IL-6水平测定结果见表1。
        量，剪碎、研磨、冰上裂解，使用Trizol法提取总RNA，用                     表1    各组大鼠血清中IL-1β、IL-6水平测定结果（x±±s，
        紫外分析仪验证RNA浓度和纯度。然后将mRNA逆转                                n＝10，ng/mL）
        录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系：                       Tab 1 Serum levels of IL-1β and IL-6 of rats in each
        SYBR荧光染料10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板                          group（x±±s，n＝10，ng/mL）
        4 μL，无核酸酶水 2 μL。引物序列：GAPDH 上游为
                                                           组别                     IL-1β           IL-6
        5′-TTCATGGCCATCAGGATG-3′，下游为 5′-TAGGC-             空白组                   21.71±8.46     20.53±9.64
        TAGCTTAAGCCTT- 3′，扩增片段长度为 421 bp；JAK1              模型组                   38.63±10.44 ＊  46.45±12.72 ＊
                                                           阳性对照组                 24.14±6.68 #   25.94±8.44 #
        上 游 为 5′-CCATGCCTTACTTGATCA-3′，下 游 为 5′-
                                                           止痛顺气胶囊低剂量组            32.92±6.53     31.86±10.42 #
        CCTACGTCGAGGTTTCAG-3′，扩增片段长度为 162                  止痛顺气胶囊中剂量组            28.89±7.35 #   30.14±10.71 #
        bp；STAT3 上游为 5′-CTCGGACTAACGATACGT-3′，下            止痛顺气胶囊高剂量组            23.93±9.64 #   26.89±5.36 #
        游为 5′-GATCACTTGCCATCAGTA-3′，扩增片段长度                     注：与空白组比较，P＜0.05；与模型组比较，P＜0.05
                                                                           ＊
                                                                                             #
                                                                                               #
                                                                             ＊
        为 251 bp；SOCS-3 上 游 为 5′-GCTACTGGCCTACCC-              Note：vs. blank group，P＜0.05；vs. model group，P＜0.05
        CTG-3′，下游为 5′-TTCAGCTCATGGGCATCC-3′，扩              3.2  大鼠胃黏膜组织的病理学观察结果
        增片段长度为 252 bp；c-Myc 上游为 5′-GCCTCAATC-                  空白组大鼠胃黏膜结构正常，可见排列紧密整齐的
        GTCCCATCG-3′，下 游 为 5′-CCGCTACCCAATCGAT-            腺体，组织柔软呈淡粉色，有光泽。模型组大鼠胃黏膜
        TC-3′，扩增片段长度为342 bp。扩增条件：94 ℃预变性                   萎缩，胃黏膜层变薄，可见排列稀疏不整齐的腺体，以及
        5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共           着色深染的细胞核。与模型组比较，阳性对照组和止痛
        40个循环。以GAPDH作为内参，采用2              －ΔΔc t 法计算各目     顺气胶囊各剂量组大鼠的胃黏膜病理情况都有明显的
        的基因的表达水平。                                          改善；其中，以阳性对照组和止痛顺气胶囊高剂量组改
        2.5  大鼠胃黏膜组织中 JAK1、STAT3、SOCS-3、c-Myc              善较为明显，胃黏膜组织中可见排列较整齐的黏膜腺
        蛋白表达水平检测                                           体，染色较深的单个核细胞数量较少。各组大鼠胃黏膜
            采用 Western blotting 法。取大鼠胃黏膜组织适量，              组织的病理学显微图见图1。
        加入裂解液充分裂解后，在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心                 3.3  大鼠胃黏膜组织中 JAK1、STAT3、SOCS-3、c-Myc
        10 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量。取30 μg                     mRNA表达水平测定结果
        蛋白，在100 V电压下进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白                         与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织中 JAK1、
        转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；将膜在 4 ℃条件下                       STAT3、c-Myc mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05），
        用 5％脱脂奶粉封闭过夜，然后用 PBST 洗膜 3 次，每次                    SOCS-3 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型
        10 min；加入 JAK1、STAT3、SOCS-3、c-Myc 和 GAPDH          组比较，阳性对照组和止痛顺气胶囊中、高剂量组大鼠
        一抗（1 ∶ 1 000），在 4 ℃条件下孵育过夜，再次用 TBST                胃黏膜组织中 JAK1、STAT3 mRNA 表达水平均显著降
        洗膜3次，每次10 min；加入二抗（1∶5 000），37 ℃下反应                低，SOCS-3 mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05）；各
        1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；用化学发光试剂显影，                   给药组大鼠胃黏膜组织中 c-Myc mRNA 表达水平均显
        采用Biodoc-IT型凝胶成像系统分析各成像蛋白条带的                       著降低（P＜0.05）。与阳性对照组比较，止痛顺气胶囊


        中国药房    2020年第31卷第11期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11  ·1311  ·
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