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2.3 差异表达蛋白的筛选 www.ebi.ac.uk/GOA/downloads）对差异表达蛋白进行基
从七味清肝散各剂量组中随机抽取 1 个肝组织样 因本体（GO）分析（包括GO注释和GO富集），使用Wolf-
品，混合，作为药物组进行后续试验。称取HF模型组和 psort V0.2 软件对上述蛋白进行亚细胞定位注释；使用
药物组肝组织样品适量至液氮预冷的研钵中，加液氮充 KAAS 在 线 服 务 工 具（http：//www.genome.jp/kaas-bin/
分研磨至粉状，均分别加入 4 倍量（μL/μg）的 8 mol/L 尿 kaas_main）对差异表达蛋白进行注释，通过KEGG map-
素溶液，超声（每超声 3 s 停 5 s）裂解 3 min，于 4 ℃下以 per 在 线 工 具（http：//www.kegg.jp/kegg/mapper.html）对
1 200 r/min 离心 10 min，去除细胞碎片。将上清液转移 通路进行匹配。富集分析采用Perl module方法，以P＜
至另一离心管中，采用BCA法测定蛋白含量。于蛋白样 0.05为显著富集。
品溶液中加入二硫苏糖醇使后者终浓度为5 mmol/L，于 2.5 统计学方法
56 ℃还原 30 min；加入碘代乙酰胺适量，室温避光孵育 采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。数据以
15 min。按质量比1 ∶ 50加入胰酶，于37 ℃酶解过夜；再 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
按质量比1∶100加入胰酶，继续同条件再次酶解4 h。经 比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
酶解后的肽段用Strata X C18除盐柱除盐后，真空冷冻干 3 结果
燥。以 0.5 mol/L TEAB 溶液溶解肽段，根据 TMT 相对 3.1 七味清肝散对大鼠HF的抑制作用
定量蛋白质组试剂盒说明书方法标记肽段。肽段经 3.1.1 一般情况 空白组大鼠健康状况良好，饮食、饮
0.1％甲酸水溶液溶解后，使用超高效液相系统进行分离 水正常，行动敏捷，体质量自然增长，毛色有光泽，大便
[色谱柱为Reprosil-Pur C18 （200 mm×0.1 mm，1.9 μm），流 成形。HF 模型组大鼠饮食减少，行动迟缓，精神萎靡，
动相为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液（A）-含0.1％甲 体质量有所下降，皮毛杂乱且无光泽，有时可见大便不
酸和 10％水的乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～42 min，6％ 成形。七味清肝散各剂量组大鼠状态介于空白组和HF
B→22％ B；42～54 min，22％ B→30％ B；54～57 min， 模型组之间。
30％B→80％B；57～60 min，80％B），流速为500 mL/min， 3.1.2 肝脏形态 空白组大鼠肝脏呈鲜红色，表面光
柱温为50 ℃，进样量为1 μg]，然后再使用质谱系统进行 滑，无粗糙感或颗粒感，且质地柔软。HF模型组大鼠肝
分析[电离源为纳升级电喷雾电离源（NSI），电压为 2.4 脏呈暗红色甚至黄色，表面粗糙，有明显的颗粒感，质地
kV；一级质谱扫描范围为m/z 350～1 550，扫描分辨率为 较硬。七味清肝散各剂量组大鼠肝脏呈暗红色，表面略
60 000；二级质谱扫描范围则固定起点为 m/z 100，扫描 粗糙，但无明显颗粒感，整体状态介于空白组和HF模型
分辨率为 17 500]。采用 MaxQuant v1.5.2.8 软件进行定 组之间。
量分析并对肽段定量值作归一化处理，筛选蛋白表达量 3.1.3 肝脏指数和肝功能指标 与空白组比较，HF 模
（即对应肽段的信号强度）差异倍数＞1.2 且 P＜0.05 的 型组大鼠肝脏系数以及肝功能指标（ALT、AST、ALP、
蛋白作为差异表达蛋白。上述试验由杭州景杰生物科 HYP）含量均显著升高（P＜0.05）。与 HF 模型组比较，
技有限公司完成。 七味清肝散各剂量组大鼠ALT、AST、HYP含量，低剂量
2.4 生物信息学分析 组肝脏系数以及高剂量组 ALP 含量均显著降低（P＜
采用 MaxQuant v1.5.2.8 软件进行差异表达蛋白的 0.05），详见表1。
质谱数据检索与解析；借助Uniprot-GOA数据库（http：// 3.1.4 肝脏纤维形态 空白组大鼠肝小叶结构完整，肝

表1 各组大鼠肝脏系数、肝功能指标以及α-SMA表达水平比较（x±±s，n＝10）
Tab 1 Comparison of hepatic index，liver function indexes and protein expression of α-SMA in rats of each group
（x±±s，n＝10）
组别 肝脏系数，％ ALT含量，U/L AST含量，U/L ALP含量，U/L HYP含量，μg/g α-SMA表达水平
空白组 3.06±0.21 11.73±6.16 17.31±2.48 14.63±4.36 352.50±37.30 0.13±0.06
HF模型组 3.91±0.62 ＊ 34.22±5.15 ＊ 41.07±9.30 ＊ 50.84±16.04 ＊ 1 151.00±173.90 ＊ 1.48±0.21 ＊
七味清肝散低剂量组 3.31±0.25 # 20.16±4.74 # 21.20±6.49 # 42.02±9.43 911.10±139.60 # 0.20±0.14 #
七味清肝散中剂量组 3.47±0.30 19.31±5.93 # 23.74±9.34 # 40.56±10.42 754.70±64.84 # 0.37±0.04 #
七味清肝散高剂量组 3.55±0.48 20.48±4.70 # 21.04±7.40 # 26.07±6.87 # 649.50±62.09 # 0.23±0.08 #
＊
#
注：与空白组比较，P＜0.05；与HF模型组比较，P＜0.05
＊
#
Note：vs. blank group，P＜0.05，vs. HF model group，P＜0.05
板排列整齐，包浆均匀，未见变性坏死、炎症细胞浸润或 板排列混乱，肝组织可见大量炎症细胞浸润、肝细胞气
纤维组织增生。HF 模型组大鼠肝小叶结构被破坏，肝 球样变、纤维组织增生，个别样本甚至出现桥间连接以

中国药房 2020年第31卷第11期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11 ·1297 ·