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古)、香青兰(批号171109,产地:内蒙古)、五灵脂(批号:                     味清肝散低、中、高剂量组[135、270、405 mg/(kg·d),以
        171215,产地:河北)、人工牛黄(批号:171030,产地:甘                   生药总量计;该药成人临床剂量为1.5~3 g/d,各组给药
        肃)、石膏(批号:171217,产地:河北)等药材均购自内蒙                      剂量根据种属间剂量折算表并按成人最低剂量的1、2、3
        古天盛蒙中医有限责任公司,由内蒙古医科大学蒙医药                            倍换算而得],每组 12 只。造模方法和干预周期参考相
        学院蒙药炮制实验中心主任呼日乐巴根副教授鉴定为                             关文献 :除空白组外,其余各组大鼠均灌胃 50%CCl4
                                                                  [12]
        真品。除人工牛黄外,其余药材均经粉碎后过100目筛,                          花生油溶液 2 mL/kg 以复制 HF 模型,每周 2 次,连续 8
        再加入人工牛黄,混合均匀(组方药材量分别为红花                             周。造模同时,空白组和 HF 模型组大鼠均灌胃等容
        180 g、香青兰 60 g、蓝盆花 60 g、人工牛黄 80 g、瞿麦 60             0.5%CMC-Na溶液,各给药组大鼠灌胃相应药物,每日1
        g、石膏 180 g、五灵脂 60 g)。临用前,以 0.5%羧甲基纤                 次,连续8周。第8周末,随机处死除空白组外的其余组
        维素钠(CMC-Na)溶液配制成质量浓度为30 mg/mL(以                     大鼠各2只,通过病理检查判断造模成功 。
                                                                                              [12]
        生药总量计,下同)的混悬液。                                      2.2 大鼠肝纤维化相关现象观察及指标检测
            水合氯醛(天津福晨化学试剂厂,批号:20141007);                    2.2.1  一般情况     在研究过程中,每周称定大鼠体质量
        花生油(山东鲁花集团,批号:20171209);四氯化碳                        1 次,并密切观察其每日饮食、饮水以及毛发、精神状态
        (CCl4,国药集团化学试剂有限公司,批号:20140319;临
                                                            等一般情况。
        用前,用灭菌花生油配制成溶液);羟脯氨酸(HYP)、丙
                                                            2.2.2  样品采集      于末次给药后,大鼠(每组 10 只,下
        氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶
                                                            同)禁食、不禁水12 h,然后腹腔注射10%水合氯醛溶液
        (ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号分
                                                            进行麻醉,经腹主动脉取血适量,静置20 min后,于4 ℃
        别为 20180523、20180429、20180421、20180428);苏木
                                                            下以3 500 r/min离心10 min,分离血清。取血后处死大
        精-伊红(HE)染色试剂盒、Masson 三色染色试剂盒、RI-
                                                            鼠,取出肝脏,分离肝组织适量,备用。
        PA 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、5×蛋白上样缓冲液
                                                            2.2.3  肝功能指标检测         采用赖氏法以紫外分光光度
        (北京索莱宝科技有限公司,批号分别为 20180927、
                                                            计检测血清中 ALT、AST 含量,采用比色法以紫外分光
        20181001、20190420、20190426、20190509);BCA蛋白浓
                                                            光度计检测血清中ALP含量,采用酸水解法以紫外分光
        度测定试剂盒、封闭液(上海碧云天生物技术有限公司,
                                                            光度计检测肝组织中HYP的含量,均严格按照相应试剂
        批号分别为122118190507、20190412);兔抗大鼠α-平滑
                                                            盒说明书操作。
        肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢
                                                            2.2.4  肝组织形态学观察         观察肝脏外观及软硬度;肝
        酶(GAPDH)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号分
                                                            脏经磷酸盐缓冲液(PBS,pH为7.2~7.4)清洗后,称定质
        别为00075696、00075847);Dylight 800标记的山羊抗兔
                                                            量,并计算其与体质量的比值(即肝脏系数)。取肝组织
        免疫球蛋白 G(IgG)二抗(美国 Abbkine 公司,批号:
                                                            适量,于4%甲醛溶液中固定48 h,经脱水、石蜡包埋、切
        ATSMR2201);串联质谱标签(TMT)相对定量蛋白质
                                                            片(厚度约 4~5 μm)后,以 HE 和 Masson 三色染色试剂
        组 试剂盒(美国 Thermo Fisher Scientific 公司,批号:
        TF266292);胰酶(美国Proemga公司,批号:121652);碘               染色,置于显微镜下观察(HF 组织经 HE 染色后可见肝
        代乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素、三乙基碳酸氢铵(TEAB)(美                       板排列混乱、炎症细胞浸润、气球样变、桥间连接等现
        国Sigma公司,批号分别为WXBC4645V、SLBM4127V、                  象,经Masson染色后则可见纤维组织增生)。
        WXBC8002V、BCBX4134);乙腈、三氟乙酸、甲酸等为色                   2.2.5  肝组织中α-SMA的表达情况           采用Western blot-
        谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水。                                 ting法检测α-SMA的表达水平。取大鼠肝组织适量,使
        1.3 动物                                              用 RIPA 裂解液裂解肝组织提取总蛋白后,采用 BCA 法
            清洁级 Wistar 大鼠 50 只,雄性,8 周龄,体质量                  检测蛋白含量。然后加入 5×蛋白上样缓冲液适量,于
        190~220 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,                       95 ℃下变性 8 min,取变性蛋白 50 μg,进行十二烷基硫
        动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。所有动物均                     酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后以湿法转膜,用封闭
        饲 养 于 内 蒙 古 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 ,室 温 18~            液室温封闭10 min,加入相应一抗(稀释度均为 1∶5 000),
        22 ℃。大鼠自由进食、饮水,适应性饲养 1 周后进行后                        于 4 ℃孵育过夜;洗膜后,加入相应二抗(稀释度为 1 ∶
        续实验。                                                2 500),室温孵育1 h;洗膜后,置于红外激光成像系统上
        2 方法                                                扫描。使用 Image Studio ver 3.1 软件进行分析,以目标
        2.1  分组、造模与给药                                       蛋白与内参蛋白(GAPDH)条带灰度值的比值来表示目
            将大鼠随机分为 5 组,即空白组、HF 模型组以及七                      标蛋白的表达水平。


        ·1296  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11                                中国药房    2020年第31卷第11期
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