Page 22 - 202011
P. 22
古)、香青兰(批号171109,产地:内蒙古)、五灵脂(批号: 味清肝散低、中、高剂量组[135、270、405 mg/(kg·d),以
171215,产地:河北)、人工牛黄(批号:171030,产地:甘 生药总量计;该药成人临床剂量为1.5~3 g/d,各组给药
肃)、石膏(批号:171217,产地:河北)等药材均购自内蒙 剂量根据种属间剂量折算表并按成人最低剂量的1、2、3
古天盛蒙中医有限责任公司,由内蒙古医科大学蒙医药 倍换算而得],每组 12 只。造模方法和干预周期参考相
学院蒙药炮制实验中心主任呼日乐巴根副教授鉴定为 关文献 :除空白组外,其余各组大鼠均灌胃 50%CCl4
[12]
真品。除人工牛黄外,其余药材均经粉碎后过100目筛, 花生油溶液 2 mL/kg 以复制 HF 模型,每周 2 次,连续 8
再加入人工牛黄,混合均匀(组方药材量分别为红花 周。造模同时,空白组和 HF 模型组大鼠均灌胃等容
180 g、香青兰 60 g、蓝盆花 60 g、人工牛黄 80 g、瞿麦 60 0.5%CMC-Na溶液,各给药组大鼠灌胃相应药物,每日1
g、石膏 180 g、五灵脂 60 g)。临用前,以 0.5%羧甲基纤 次,连续8周。第8周末,随机处死除空白组外的其余组
维素钠(CMC-Na)溶液配制成质量浓度为30 mg/mL(以 大鼠各2只,通过病理检查判断造模成功 。
[12]
生药总量计,下同)的混悬液。 2.2 大鼠肝纤维化相关现象观察及指标检测
水合氯醛(天津福晨化学试剂厂,批号:20141007); 2.2.1 一般情况 在研究过程中,每周称定大鼠体质量
花生油(山东鲁花集团,批号:20171209);四氯化碳 1 次,并密切观察其每日饮食、饮水以及毛发、精神状态
(CCl4,国药集团化学试剂有限公司,批号:20140319;临
等一般情况。
用前,用灭菌花生油配制成溶液);羟脯氨酸(HYP)、丙
2.2.2 样品采集 于末次给药后,大鼠(每组 10 只,下
氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶
同)禁食、不禁水12 h,然后腹腔注射10%水合氯醛溶液
(ALP)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号分
进行麻醉,经腹主动脉取血适量,静置20 min后,于4 ℃
别为 20180523、20180429、20180421、20180428);苏木
下以3 500 r/min离心10 min,分离血清。取血后处死大
精-伊红(HE)染色试剂盒、Masson 三色染色试剂盒、RI-
鼠,取出肝脏,分离肝组织适量,备用。
PA 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、5×蛋白上样缓冲液
2.2.3 肝功能指标检测 采用赖氏法以紫外分光光度
(北京索莱宝科技有限公司,批号分别为 20180927、
计检测血清中 ALT、AST 含量,采用比色法以紫外分光
20181001、20190420、20190426、20190509);BCA蛋白浓
光度计检测血清中ALP含量,采用酸水解法以紫外分光
度测定试剂盒、封闭液(上海碧云天生物技术有限公司,
光度计检测肝组织中HYP的含量,均严格按照相应试剂
批号分别为122118190507、20190412);兔抗大鼠α-平滑
盒说明书操作。
肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢
2.2.4 肝组织形态学观察 观察肝脏外观及软硬度;肝
酶(GAPDH)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号分
脏经磷酸盐缓冲液(PBS,pH为7.2~7.4)清洗后,称定质
别为00075696、00075847);Dylight 800标记的山羊抗兔
量,并计算其与体质量的比值(即肝脏系数)。取肝组织
免疫球蛋白 G(IgG)二抗(美国 Abbkine 公司,批号:
适量,于4%甲醛溶液中固定48 h,经脱水、石蜡包埋、切
ATSMR2201);串联质谱标签(TMT)相对定量蛋白质
片(厚度约 4~5 μm)后,以 HE 和 Masson 三色染色试剂
组 试剂盒(美国 Thermo Fisher Scientific 公司,批号:
TF266292);胰酶(美国Proemga公司,批号:121652);碘 染色,置于显微镜下观察(HF 组织经 HE 染色后可见肝
代乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素、三乙基碳酸氢铵(TEAB)(美 板排列混乱、炎症细胞浸润、气球样变、桥间连接等现
国Sigma公司,批号分别为WXBC4645V、SLBM4127V、 象,经Masson染色后则可见纤维组织增生)。
WXBC8002V、BCBX4134);乙腈、三氟乙酸、甲酸等为色 2.2.5 肝组织中α-SMA的表达情况 采用Western blot-
谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水。 ting法检测α-SMA的表达水平。取大鼠肝组织适量,使
1.3 动物 用 RIPA 裂解液裂解肝组织提取总蛋白后,采用 BCA 法
清洁级 Wistar 大鼠 50 只,雄性,8 周龄,体质量 检测蛋白含量。然后加入 5×蛋白上样缓冲液适量,于
190~220 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 95 ℃下变性 8 min,取变性蛋白 50 μg,进行十二烷基硫
动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。所有动物均 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后以湿法转膜,用封闭
饲 养 于 内 蒙 古 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 ,室 温 18~ 液室温封闭10 min,加入相应一抗(稀释度均为 1∶5 000),
22 ℃。大鼠自由进食、饮水,适应性饲养 1 周后进行后 于 4 ℃孵育过夜;洗膜后,加入相应二抗(稀释度为 1 ∶
续实验。 2 500),室温孵育1 h;洗膜后,置于红外激光成像系统上
2 方法 扫描。使用 Image Studio ver 3.1 软件进行分析,以目标
2.1 分组、造模与给药 蛋白与内参蛋白(GAPDH)条带灰度值的比值来表示目
将大鼠随机分为 5 组,即空白组、HF 模型组以及七 标蛋白的表达水平。
·1296 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 11 中国药房 2020年第31卷第11期