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分 [3-6] 。目前普遍认为麻黄生物碱类成分是其平喘的活                      规格：500 mL）；汉克斯平衡盐溶液（HBSS）和Mc Coy’s
        性成分，其中的麻黄碱和伪麻黄碱可兴奋支气管平滑肌                           5A培养液（美国Gibco公司）；甲醇、甲酸为色谱纯，其他
        上的β 2受体，从而达到平喘作用            [7-8] 。然而，麻黄生物碱        试剂均为分析纯，水为去离子水。
        类成分已报道的副作用也较多，比如可引起高血压、心                           1.3 细胞
        肌梗死、震颤、痉挛、中风等 。近年来，关于麻黄中非生                             人直肠癌 HT-29 细胞购自中国科学院上海细胞生
                               [9]
        物碱类成分的研究引起了人们的重视。日本学者的最                            物学研究所细胞库。
        新研究表明，去除了生物碱的麻黄提取物与麻黄总提取                           2 方法与结果
        物相比，前者镇痛、抗流感、抑制肿瘤转移等作用并无                           2.1 麻黄非生物碱类组分的富集和制备
        明显变化，同时还消除了麻黄生物碱引起的失眠、心律                               取麻黄干燥草质茎1 kg，用5倍量的85％乙醇（L/kg）
        失常等典型副作用        [10-11] 。在前期研究中，本课题组通过             在80 ℃回流提取3次，每次2 h；合并3次提取液，过滤后
        大鼠实验对麻黄非生物碱类组分的抗过敏性哮喘作用                            减压浓缩，得浓缩液 250 mL（质量浓度为 600 mg/mL，
        进行了考察，结果表明这类组分具有显著降低致敏大                            以提取物计，下同）。取该浓缩液 50 mL，加 500 mL 甲
        鼠血清中免疫球蛋白 E（IgE）和白三烯（LT）含量、显著                      醇，充分溶解；用相同体积正庚烷萃取3次，回收溶剂，得
        减少全血和肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞（EOS）数量以                          甲醇层提取物（128 g）和正庚烷层提取物。取甲醇层
        及 显 著 缩 小肺组织炎症面积的作用（专利申请号：                         提取物 1.25 g，分散于 25 mL 甲醇-水-甲酸（25 ∶ 75 ∶ 0.1，
        201711011998.5），这提示非生物碱类成分也可能是麻黄                   V/V/V）溶液中，离心（8 000 r/min）10 min，得到上清液部
        平喘的有效成分。                                           分 25 mL（质量浓度为 44 mg/mL）和沉淀部分 135 mg。
            无标记细胞整合药理学技术（Cellular label-free in-           取该上清液0.5 mL，上样AC18 SPE柱（dp＝60 μm，6 mL）
        tegrative pharmacology，CLIP）是经谐振波导光栅生物传            [柱子用8 mL甲醇活化，8 mL甲酸-水（0.1 ∶ 100，V/V）溶
        感器将细胞受药物刺激产生的动态质量重置（Dynamic                        液平衡]，抽干SPE柱，弃去上样流出液；用8 mL 甲酸-水
        mass redistribution，DMR）响应信号记录为可视化谱线 ，             （0.1 ∶ 100，V/V）溶液淋洗 AC18 SPE 柱并抽干，收集淋洗
                                                     [12]
        从而反映药物作用靶点和通路的技术。本课题组前期                            液，即得淋洗液部分；再用8 mL甲醇-水-甲酸（5∶95∶0.1，
        通过 CLIP 技术研究发现，麻黄非生物碱类成分草质素                        V/V/V）溶液洗脱，收集洗脱液，即得5％甲醇酸水洗脱部
        具有较强的激动 G 蛋白偶联受体 35（GPR35）受体的活                     分；最后用8 mL甲醇-水（95∶5，V/V）溶液洗脱，收集洗脱
          [13]
        性 ，而GPR35受体被认为是哮喘治疗的新靶标                 [14-15] 。因  液，即得 95％甲醇洗脱部分。其中，沉淀部分和 95％甲
        此，本研究拟通过对麻黄提取物进行非生物碱类组分富                           醇洗脱部分为富集后的非生物碱部位，将这两部分用旋
        集和制备、活性组分筛选以及其化学成分质谱表征，进                           转蒸发仪蒸干，待用。
        一步探讨麻黄非生物碱部位抗过敏性哮喘的有效成分                                取上述沉淀部分样品，用甲醇-水（70 ∶ 30，V/V）溶解
        及作用靶点，为阐明麻黄抗过敏性哮喘的药效物质基础                           后，上样Unitary C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）。设
        提供理论依据。                                            置色谱条件：流动相为甲醇（A）-0.1％甲酸-水（B），梯度
        1 材料                                               洗脱（0～60 min，40％A→95％A；60～80 min，95％A）；
        1.1  仪器                                            流速为 0.5 mL/min；检测波长为 315 nm；进样量为 50
            1290 型高效液相色谱仪、6540 型高分辨质谱仪（德                   µL。上样后按色谱峰进行流分收集。结果，共收集得到
        国 Agilent 公司）；LC-20A 型半制备型高效液相色谱仪                  10个流分，记为F1.1～F1.10，结果详见图1A。
       （日本Shimadzu公司）；Milli-Q型去离子水发生器（美国                       取上述95％甲醇洗脱部分样品，用甲醇-水（50 ∶ 50，
        Millipore 公司）；CX23 型光学显微镜（日本 Olympus 公             V/V）溶液溶解后，上样Eclipse XDB-C18半制备型色谱柱
        司）；5415R 型高速离心机（德国 Eppendorf 公司）；Hera-             （250 mm×9.4 mm，5 µm）。设置色谱条件：流动相为甲
        cell 240i型CO2恒温培养箱（美国Thermo Fisher Scientif-       醇（A）-0.1％甲酸-水（B），梯度洗脱（0～25 min，30％
        ic公司）；Epic 384孔生物感应器微型板、Epic 系统（美                  A→50％ A；25～50 min，50％ A→95％ A）；流 速 为 2
                                               ®
                   ®
        国Corning公司）。                                       mL/min；检测波长为 254 nm；进样量为 50 µL。上样后
        1.2 药品与试剂                                          按色谱峰进行流分收集。结果，共得到10个流分，记为
            麻黄药材于2016年8月30日采自内蒙古地区，原植                      F2.1～F2.10，结果详见图1B。
        物经沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定为草麻黄                            2.2 麻黄非生物碱部位抗过敏性哮喘活性组分的筛选
       （E. sinica Stapf）的干燥草质茎，标本保存于大连大学生                      参考文献方法       [13，16] 进行试验。将处于对数生长期的
        命科学与技术学院标本室（标本号：20160830）；敏喘宁                      HT-29 细胞按 3.0×10 个/孔的密度接种到 Epic 384 孔生
                                                                             4
                                                                                                   ®
        标准品（美国 Sigma-Aldrich 公司，批号：Z0878，纯度：≥              物感应器微型板中，置于5％CO2、37 ℃恒温培养箱中培
        98％）；二甲基亚砜（DMSO）溶液（美国 Bio Basic 公司，                养 22～24 h。在检测之前将 Epic 384 孔板中的培养液
                                                                                        ®

        中国药房    2020年第31卷第9期                                              China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 9  ·1069  ·
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