Page 47 - 202009

表3 金银花药材的主成分分析结果 上述沉淀分别于 60 ℃真空干燥，得总多糖样品和 20％
Tab 3 Results of principle component analysis of L. 醇沉多糖样品、50％醇沉多糖样品、80％醇沉多糖样品
japonica （根据多糖醇沉性质，当乙醇浓度低时，所得醇沉样品中
初始特征值 提取平方和载入 旋转平方和载入 的多糖分子量大；醇沉浓度参考相关文献 [10，15] 设置）。
成分 方差， 累积贡献 方差， 累积贡献 方差， 累积贡献
特征值 特征值 特征值 2.8.2 RSV扩增 取RSV，加入至长成单层的Vero细胞
％ 率，％ ％ 率，％ ％ 率，％
1 5.659 47.161 47.161 5.659 47.161 47.161 4.270 35.586 35.586 中，确保病毒量占完全培养基（即含2％胎牛血清的RP-
2 2.745 22.875 70.036 2.745 22.875 70.036 3.145 26.207 61.794 MI 1640 培养基，下同）的 10％，于 37 ℃、5％CO2培养箱
3 1.724 14.364 84.400 1.724 14.364 84.400 2.713 22.607 84.400 中培养（培养条件下同）。待细胞生长至90％时收集，参
4 0.816 6.804 91.204
[16]
5 0.421 3.512 94.716 考相关文献方法 将细胞反复冻融（－80～37 ℃）3 次，
6 0.233 1.938 96.654 以 1 000 r/min 离心 10 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱
7 0.211 1.761 98.415 中冻存，备用。
8 0.124 1.032 99.447
9 0.061 0.504 99.951 2.8.3 病毒毒力测定 取 Vero 细胞适量，经胰酶消化
10 0.005 0.042 99.993 后，按 1×10 个/孔接种至 96 孔板中，培养 24 h 至细胞长
4
11 0.001 0.007 100.000
－13
12 －1.000×10 －1.000×10 －13 100.000 成单层，弃去培养基。用完全培养基将“2.8.2”项下上清
液（即 RSV）进行 10 倍递次稀释，按每孔 100 μL 将各稀
6
释度的病毒液接种至细胞中，即为病变组；同时设置细
5
胞对照组（含完全培养基 100 µL 但不含病毒）。每组设
4 置4个复孔。细胞培养24 h后，每孔加MTT试剂20 μL，
特征值 3 继续培养 4 h，弃去上清液；加入二甲基亚砜 100 μL，同
2
时设置空白组（仅含二甲基亚砜100 μL），使用酶标仪于
1
492 nm 波长处测定各孔光密度（OD）值，并计算细胞存
0 [17]
活率（公式①）；根据 Reed-Muench 法（公式②③） 计算
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
成分数 病毒半数感染浓度（TCID50 ），以确定后续研究的病毒液
图4 金银花药材的碎石图 浓度。
Fig 4 Gravel map of L. japonica 细胞存活率（％）＝（病变组平均OD值－空白组平均
表4 12批药材样品的主成分得分、综合得分及排名 OD 值）/（细胞对照组平均 OD 值－空白组平均 OD 值）×
Tab 4 Principal component score， comprehensive 100％ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ①
score and ranking of 12 batches of samples TCID50＝Antilg[高于50％细胞病变效应（CPE）百分
批次 主成分1得分 主成分2得分 主成分3得分 综合得分 排名 率病毒稀释度+比距] … … … … … … … … … … … … … ②
S1 2.164 －1.325 －2.088 0.417 3 比距（％）＝（高于 50％存活率－50％）/（高于 50％
S2 －1.062 －1.255 0.275 －0.748 9 存活率－低于50％存活率）×100％ … … … … … … … ③
S3 －1.059 －1.529 0.642 －0.757 10
S4 0.199 －1.471 2.491 0.115 4 结果，RSV的TCID50值为10 －2.13 ，故选取RSV的100
S5 1.475 0.497 1.318 0.999 2 倍TCID50值作为病毒液浓度。
S6 －1.797 0.411 0.314 －0.708 8 2.8.4 多糖样品细胞毒性测定 取Vero细胞适量，经胰
S7 0.160 1.246 －2.069 0.063 5
4
S8 －1.982 0.719 －0.140 －0.790 11 酶消化后，按 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，培养过夜。
S9 －1.732 3.164 0.425 －0.032 6 依据前期预试验结果，将总多糖、80％醇沉多糖、50％醇
S10 －1.451 1.338 －0.438 －0.441 7
S11 －1.191 －2.695 －1.118 －1.339 12 沉多糖、20％醇沉多糖分别用 RPMI 1640 培养基从 80
S12 6.276 0.901 0.388 3.222 1 g/L 起以 2 倍比连续稀释共 10 个梯度后，按每孔 100 µL

2.8 金银花多糖的体外抗RSV研究 分别转移至细胞中；同时设细胞对照组（含完全培养基
2.8.1 多糖样品处理 取“2.7”项下综合得分最高的金 100 µL）和利巴韦林阳性对照组（用完全培养基稀释的
银花药材（编号：S12），按“2.1”项下方法制备金银花多 利巴韦林药液 100 µL；依据前期预试验结果，从 250
糖样品，即为总多糖。取上述总多糖用水溶解后，加 µg/mL 起以 2 倍比连续稀释共 10 个梯度）。每组设 4 个
0.25倍量无水乙醇进行20％醇沉，静置过夜，收集沉淀； 复孔。细胞培养 24 h 后，按“2.8.3”项下 MTT 法使用酶
继续于上清液中加入 0.6 倍量无水乙醇进行 50％醇沉， 标仪于492 nm波长处测定各孔OD值，按公式①计算细
[18]
静置过夜，收集沉淀；继续于上清液中加入1.5倍量无水 胞存活率，并根据 Reed-Muench 法（公式④） 计算药物
乙醇进行 80％醇沉，静置过夜，收集沉淀。将总多糖和 对细胞的半数中毒浓度（TC50 ），结果见表 5。由表 5 可

中国药房 2020年第31卷第9期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 9 ·1065 ·