Page 48 - 202009
P. 48

见，4 种多糖样品的 TC50 值分别为 11.67、11.29、12.04、             3 讨论
        12.83 g/L，因此确定多糖的最大无毒浓度为20 g/L 。                        中药指纹图谱是目前能够被国内外学者普遍接受
                                                   [19]
            TC50＝[Antilg（高于 50％CPE 百分率加药组稀释                 的一种中药质量评价方法，其可直接将疗效相关的有效
        度+比距）×C…     … … … … … … … … … … … … … … … … ④      成分作为考察指标，突出中药成分的完整面貌，可满足
            式中，C为第1孔药物的终质量浓度，即最高剂量。                         中医药传统理论整体性研究的需要。基于此，本研究通
            表5 金银花各多糖成分对Vero细胞的TC50值                        过GC法建立金银花多糖指纹图谱，对不同产地的12批
        Tab 5 TC50 of L. japonica polysaccharides on Vero   金银花药材进行质量对比分析，旨在为金银花药材的质
                cells                                       量控制提供参考。
        供试品            TC50，g/L  供试品           TC50，g/L         当样品制备方法不同时，其所获得的色谱指纹图谱
        总多糖             11.67    20％醇沉多糖      12.83         差异很大，分析结果也完全不同 。因此，在指纹图谱
                                                                                        [22]
        80％醇沉多糖         11.29    利巴韦林         19.69×10 －3
        50％醇沉多糖         12.04                               分析中，必须重视样品的制备方法。在前期研究中，笔
                                                            者对提取方法（传统热水提取法、超声辅助热水提取
        2.8.5  体外抗病毒测定         取Vero细胞适量，经胰酶消化
                                                            法）、醇沉次数（一次醇沉、二次醇沉）等因素进行了考
                  4
        后，按 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，培养 24 h 至细胞长
                                                            察。在综合考虑 GC 色谱峰峰形、对称性及分离度等因
        成单层后，弃去培养基。用RPMI 1640培养基将多糖样
                                                            素的影响后，发现两种提取方法所得的色谱峰峰形相
        品从最大无毒浓度起依次以2倍比稀释，制得20、10、5、
                                                            似，但采用传统热水提取法时，所得色谱峰尖锐、对称，
        2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04 g/L 含药培养基，依
                                                            多糖得率高；与一次醇沉相比，二次醇沉后所得多糖的
        次吸取50 μL至96孔板中，各加病毒液50 μL；同时设细
                                                            分离效果较好。因此，最终确定采用传统热水提取法并
        胞对照组（含完全培养基 100 µL）、模型组（含病毒液
                                                            进行二次醇沉制备多糖。
        100 µL）和利巴韦林组（含利巴韦林的完全培养基 100
                                                                由方法学考察结果可以看出，本研究所建立的金银
        µL；根据“2.8.4”项下结果，从 60 µg/mL 起以 2 倍比连续
                                                            花多糖指纹图谱分析方法准确、可靠。共指认7个共有
        稀释共10个梯度）。每组设4个复孔。细胞培养至模型
                                                            峰，且各批金银花药材多糖样品的相似度≥0.994，表明
        组病变至 90％（根据细胞形态判断）时，按“2.8.3”项下
                                                            市售药材样品化学成分相对稳定，药材成分具有较好的
        MTT法使用酶标仪于492 nm波长处检测各孔OD值，按
                                                            一致性。
        公式①计算细胞存活率，并根据 Reed-Muench 法（公式
                                                                聚类分析可在事物分类面貌尚不明确的情况下讨
              [18]
        ⑤⑥） 计算药物的半数有效浓度（EC50 ）及治疗指数
                                                                                                         [23]
                                                            论事物的分类情况，是“无师可寻”的统计分类方法 。
        （TI），结果见表6。
                                                            聚类分析结果显示，主产于东北地区的药材（S1、S7、
            EC50＝[Antilg（高于 50％CPE 百分率药物稀释度－
                                                            S10、S11）聚为一类，主产于山东、河南两地的药材（S2、
        比距）×C …    … … … … … … … … … … … … … … … … … ⑤
                                                            S4、S5、S8、S9、S12）聚为一类。主成分和因子分析结果
                 TC50
            TI＝        … … … … … … … … … … … … … … … ⑥      显示，主产于山东的 S12 品质最好，主产于河南的 S5 品
                 EC50
                                                            质次之，主产于吉林的 S11 最末，提示由于气候环境的
              表6   金银花各多糖成分的抗病毒试验结果
                                                            不同，不同产地的金银花药材在质量上存在差异。
        Tab 6  Results of antiviral tests of L. japonica polysac-
                                                                                                    [24]
                                                                金银花是临床上治疗呼吸道感染的要药 。研究
               charides
                                                            表明，RSV 是引起呼吸道病毒感染的主要病原之一，但
        供试品       EC50，g/L  TI   供试品        EC50，g/L  TI    由于缺乏疫苗且化学药致不良反应较多，RSV所致感染
        总多糖        0.76    15.36  20％醇沉多糖   3.04    4.22
        80％醇沉多糖    0.61    18.51  利巴韦林      1.02×10 －3  20.08  的临床治疗方案一直存有争议          [25-26] 。利巴韦林作为广谱
        50％醇沉多糖    1.03    11.69                            抗病毒药物，抗病毒活性强，但毒性较大，易造成可逆性
            OD 值在一定范围内与活细胞数量成正比，由 MTT                       溶血性贫血，故其临床应用受限 。因此，开发金银花
                                                                                        [27]
        法测得细胞组 OD 值为 0.740 5，RSV 感染的模型组 OD                  等抗 RSV 中药具有一定的价值。本研究从多糖最大无
        值为0.172 1，表明在RSV干预下，细胞的存活率有所降                       毒浓度开始连续2倍比稀释，以排除药物本身的毒性作
                        [20]
        低，模型复制成功 。由表 6 可见，金银花总多糖、80％                        用，且安全范围相对较宽，符合临床用药标准 ；所选用
                                                                                                   [28]
        醇沉多糖、50％醇沉多糖、20％醇沉多糖的 TI 值分别为                       的 TI 值可反映药物对病毒的抑制作用，当 TI＞4 时，即
        15.36、18.51、11.69、4.22。一般认为当 TI＞4 时，即为有             可认为药物有效，且该值越大则表明药物对病毒的抑制
          [21]
        效 。因此，上述4种金银花多糖对RSV 均具有一定的                          作用越强     [21，29] 。本研究结果显示，不同多糖样品抑制
        体外抑制活性，其中 80％醇沉多糖活性最强，且 TI 值                        RSV的TI值均大于4，可认为其均具有体外抗病毒的作
        （18.51）与阳性对照（20.08）接近；总多糖活性次之。                      用，且活性由高到低依次为80％醇沉多糖、总多糖、50％


        ·1066  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 9                                  中国药房    2020年第31卷第9期
   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53