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2.2 肺泡灌洗液中的中性粒细胞凋亡情况考察                              料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
            ALI模型复制24 h后，麻醉小鼠，分离其气管，将导                      两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。
        管插入支气管，注入 0.5 mL 生理盐水灌洗，并反复抽吸                       3 结果
        灌洗液，重复灌洗 5 次；收集灌洗液，以 250×g 离心 10                    3.1 Res 对 ALI 模型小鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞
        min，弃去上清液，沉淀加磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～                     凋亡的影响
        7.4）1 mL，轻柔吹打、重悬，吸取上述细胞悬液（细胞计                           正常组小鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞呈浅蓝色，
        数约为1×10 个/L）20 μL至载玻片上，以固定液（甲醇-冰                    凋亡细胞较少；模型组小鼠肺泡灌洗液中可见明显亮蓝
                   5
        乙酸，体积比3 ∶ 1）处理15 min后，用Hoechst 33242染色              色凋亡中性粒细胞，并可见细胞核固缩、碎裂等现象，且
        液于室温避光条件下染色15 min，置于激光共聚焦扫描                         其凋亡率较正常组显著升高（P＜0.01）；各给药组小鼠
        显微镜下观察。每个样本选择 500 个细胞进行观察，记                         肺泡灌洗液中凋亡中性粒细胞明显增多，且凋亡率均较
        录中性粒细胞的凋亡情况（凋亡细胞细胞核呈亮蓝色，                            模型组显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），详见图 1（图中，
        正常细胞细胞核呈淡蓝色）。另取上述细胞悬液 100                           粗箭头表示正常细胞，细箭头表示凋亡细胞）、图2、表1。
        μL，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染色试剂各5 μL，于室温
        避光条件下染色20 min，使用流式细胞仪检测中性粒细
        胞的凋亡率（FITC 荧光波长设为 530 nm，PI 波长设为
        560 nm；FL1 通道检测绿色荧光，FL3 检测红色荧光）。
        以上试验重复3次。
        2.3 血浆中IL-6、TNF-α含量检测
            在灌洗前，于小鼠腹主动脉取血 1 mL，置于肝素抗                                  A. 正常组             B. 模型组
        凝采血管中，摇匀，以1 000×g离心3 min，分离血浆。采
        用 ELISA 法以酶标仪检测各组小鼠血浆中 IL-6、TNF-α
        的含量，严格按照相应试剂盒说明书操作。
        2.4  肺湿质量/干质量比值检测
            取血后，采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，取其右肺
        上叶，称定湿质量（W）；于80 ℃恒温干燥箱中烘烤约48
        h 至恒定质量，记为干质量（D）；计算各组小鼠肺湿质                                   C. 阳性对照组            D. Res低剂量组
        量/干质量（W/D）比值。
        2.5  肺组织形态学观察
            采用 HE 染色法观察。称定肺质量后，取小鼠肺组
        织适量，置于4％多聚甲醛溶液中固定24 h，经常规石蜡
        包埋、切片（厚度约1～2 μm）后，以HE染色，并置于光学
        显微镜下观察肺组织的形态学特征。
        2.6  肺组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量检测                                 D. Res中剂量组           E. Res高剂量组
            采用 Western blotting 法检测。取小鼠肺组织适量，               图1 Res对ALI模型小鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞
        用蛋白提取试剂盒提取肺组织蛋白，使用 BCA 法测定                               凋亡影响的显微图（Hoechst 33242染色，×200）
        蛋白含量。煮沸10 min使蛋白变性，于4 ℃以12 000×g                    Fig 1 Micrographs of the effects of Res on the apopto-
        离心3 min，取沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝                               sis of neutrophils in BALF of ALI model mice
        胶电泳（SDS-PAGE）[恒流（10 mA）至分离胶后改为恒压                         （Hoechst 33242 staining，×200）
        （100 V）]。电泳结束后，转膜，加入相应一抗（稀释度均                       3.2 Res对ALI模型小鼠血浆中IL-6、TNF-α含量的影响
        为1∶1 000），加BSA 2 mL，于4 ℃孵育过夜，用三羟甲基                      与正常组比较，模型组小鼠血浆中IL-6、TNF-α含量
        氨基甲烷盐酸盐（TBST）溶液清洗 10 min×5 次；加入相                    均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组上述指
        应二抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），室温孵育1 h，用TBST溶                  标含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见表2。
        液洗涤10 min×5次。经ECL化学发光显色液显色后，置                       3.3 Res对ALI模型小鼠肺W/D比值的影响
        于凝胶成像系统中成像，使用Image Pro-plus 6.0软件分                      与正常组比较，模型组小鼠肺 W/D 比值显著升高
        析。以相应蛋白与内参（β-actin）的灰度值比值表示该蛋                      （P＜0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肺W/D比值均
        白的相对表达量。以上试验重复3次。                                   显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见表3。
        2.7  统计学方法                                          3.4 Res对ALI模型小鼠肺组织形态学特征的影响
            采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资                          正常组小鼠肺组织结构完整，肺泡腔干净，肺泡壁


        ·1036  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 9                                  中国药房    2020年第31卷第9期
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