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恒温游泳箱中进行游泳负重实验。每次下水的小鼠不                             鼠抗疲劳效果考察。考虑到抗疲劳活性以小鼠运动能
        超过4只，彼此不得靠近。用秒表记录小鼠从入水至头                            力为主、血液/组织中相关生化指标为辅，分别对小鼠负
        部全部没入水中（以小鼠鼻孔下沉入水并持续 8 s 未能                         重游泳时间、血清尿素氮含量、肝糖原含量、血乳酸曲线
        浮出水面为准）为止的时间，作为小鼠负重游泳时间。                            下面积等 4 项指标赋予权重 0.4、0.2、0.2、0.2，则综合评
        2.2.3  小鼠运动后血清尿素氮含量的测定                  在末次给        分（Y）＝0.4×小鼠负重游泳时间/小鼠负重游泳时间最大
        药30 min后，将小鼠置于“2.2.2”项下恒温游泳箱中不负                     值+0.2×血清尿素氮含量最小值/血清尿素氮含量+0.2×
        重游泳90 min，游泳结束休息30 min后，摘其眼球采血，                     肝糖原含量/肝糖原含量最大值+0.2×血乳酸曲线下面积
        以3 000 r/min离心10 min。取上层血清，按尿素氮检测                   最小值/血乳酸曲线下面积。采用 Y 值综合比较复方人
        试剂盒说明书方法操作，测定血清中尿素氮含量。                              参健体方不同处方配比的抗疲劳效果。Box-Behnken设
        2.2.4  小鼠运动后肝糖原含量的测定               在末次给药 30         计的因素与水平见表1。
        min 后，将小鼠置于“2.2.2”项下恒温游泳箱中不负重游                             表1 Box-Behnken设计的因素与水平
        泳90 min，游泳结束后立即颈椎脱臼处死，取出肝脏，置                           Tab 1 Factors and levels of Box-Behnken design
        于冰生理盐水中剔除结缔组织，然后以滤纸吸干。称取                                                     因素
                                                            水平
        适量肝脏组织，按糖原检测试剂盒说明书方法操作，测                                  人参处方量（A），g  山药处方量（B），g  枸杞子处方量（C），g 益智仁处方量（D），g
                                                            －1        1          8          9         2
        定肝糖原含量。
                                                             0        1.5        9         10         3
        2.2.5  小鼠运动后血乳酸含量及其曲线下面积的测定                          1        2          10        11         4
          末次给药 30 min 后，于小鼠眼眶静脉丛取血 0.1 mL                   2.5 最优配比复方人参健体方的抗疲劳活性验证试验
        （血样置于肝素钠处理的采集管中抗凝，下同），然后将                               按“2.4”项下 Box-Behnken 响应面法优选的复方人
        其置于“2.2.2”项下恒温游泳箱中不负重游泳 10 min。                     参健体方日服处方量配比称取4种组方药材饮片，混合
        分别于游泳结束后第 0、20 min 时于其眼眶静脉丛再取                       后适当粉碎，按“2.1”项下方法提取，得提取物 4.9 g（得
        血0.1 mL。取上述全血样品，按乳酸检测试剂盒说明书                         率为20.00％）。按成人体质量60 kg计算每1 kg体质量
        方法分别测定游泳前后3个不同时间点血乳酸含量，并                            的成人日服总生药量（4 种组方饮片质量之和为 24.5 g，
        按公式计算血乳酸曲线下面积              [6-7] ：血乳酸曲线下面积＝         下同）为 0.408 g/kg。分别以该人体服用剂量的 10、20、
        5×（游泳前血乳酸含量+3×游泳结束后第0 min时的血乳                       30 倍作为小鼠给药的低、中、高剂量（4.08、8.16、12.24
        酸含量+2×游泳结束后第20 min时的血乳酸含量）。                         g/kg，以生药量计）。
        2.3  单因素试验初步筛选复方人参健体方的处方配比                              取 200 只小鼠，分为空白对照组、阳性对照组（人参
            结合临床用药剂量及本课题组前期预试验结果，以                          红景天胶囊，0.135 g/kg，剂量参考“2.2.1”项下方法进行
        人参处方量（A）2 g，山药处方量（B）7 g、枸杞子处方量                      设置，相当于人日用量的 20 倍）和复方低、中、高剂量
        （C）8 g、益智仁处方量（D）3 g为基础因素条件。单独调                      组[最优配比复方人参健体方提取物（以下简称为“优化
        整每个因素水平，具体为：（1）固定山药、枸杞子、益智仁                         复方”），以生药量计算]，每组40只。复方各剂量组小鼠
        处方量分别为 7、8、3 g，考察人参不同处方量（1、1.5、2、                   灌胃优化复方溶液，阳性对照组小鼠灌胃人参红景天胶
        2.5、3 g）；（2）固定人参、枸杞子、益智仁处方量分别为2、                    囊药液，空白对照组小鼠灌胃等体积水，灌胃体积均为20
        8、3 g，考察山药不同处方量（3、5、7、9、11 g）；（3）固定人                mL/kg，每日灌胃1次，连续30 d。
        参、山药、益智仁处方量分别为 2、7、3 g，考察枸杞子不                           首次灌胃给药前及末次灌胃给药前测定并记录小
        同处方量（4、6、8、10、12 g）；（4）固定人参、山药、枸杞子                  鼠体质量，观察小鼠生长发育及活动情况。末次给药后
        处方量分别为2、7、8 g，考察益智仁不同处方量（1、2、3、                     按“2.2.2”～“2.2.5”项下操作，分别测定小鼠抗疲劳试验
        4、5 g）。按上述配比共设计20组试验，每组10只小鼠，                       4项指标（每项指标10只小鼠），验证优化复方对小鼠的
        按“2.2.1”“2.2.2”项下方法给药后进行小鼠负重游泳时                     抗疲劳活性。以复方中剂量组小鼠的测定数据计算综
        间考察，初步比较复方人参健体方不同处方配比的抗疲                            合评分（Y），比较其与理论预测值的差距。
        劳效果。                                                2.6  最优处方配比复方人参健体方的小鼠急性毒性
        2.4 Box-Behnken 响应面法优化复方人参健体方的处                     实验
        方配比                                                     参照本课题组前期研究 ，取小鼠20只，雌雄各半，
                                                                                    [8]
            以单因素试验结果为基础，进行 Box-Behnken 响应                   灌胃优化复方溶液（以水配制成0.40 g/mL的药液，以提
        面试验。以人参处方量（A，g）、山药处方量（B，g）、枸杞                       取物计），每次20 mL/kg，灌胃2次，给药间隔6 h[灌胃总
        子处方量（C，g）、益智仁处方量（D，g）为自变量，以小鼠                       剂量为 16.00 g/kg（以提取物计），相当于“2.4”项下优选
        负重游泳运动时间和运动后血清尿素氮、肝糖原、血乳                            的成人日服用剂量的约196倍]。给药后，连续14 d观察
        酸等4个指标的综合评分值为因变量（响应面值），设计                           并记录小鼠的一般状态、体质量变化、中毒特征以及死
        不同处方配比的4因素3水平响应面试验方案并进行分                            亡情况等，并测定半数致死量（LD50 ）和最大耐受剂量
        组实验，每组10只小鼠，按“2.2”项下方法给药后进行小                       （MTD）。


         ·928  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 8                                  中国药房    2020年第31卷第8期
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