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（C-6），156.3（C-7），94.2（C-8），152.4（C-9），105.9         养基，每孔加入无血清的 DMEM 培养基 100 µL 和 5
       （C-10），130.5（C-1′），126.2（C-2′6′），129.2（C-3′5′），     mg/mL 的 MTT 溶液 10 µL，继续培养 4 h，加入 150 μL
        131.9（C-4′），66.2（OCH3 ），99.3（C-1‴），72.9（C-2‴），75.8  DMSO低速振荡10 min溶解结晶。采用酶标仪在490 nm
       （C-3‴），71.2（C-4‴），75.3（C-5‴），170.0（C-6‴）。上述数        波长处测定吸光度（OD）值，重复3次，计算HepG2细胞
                    [15]
        据与文献方法 报道一致，故推测代谢物 1 为千层纸素                         的增殖抑制率：增殖抑制率＝[1－（OD 试验组－OD 空白对照组 ）/
        A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，其结构式详见图3A。                        （OD 阳性对照组－OD 空白对照组）]×100％；并根据概率法 计算
                                                                                                     [18]
                                                           代谢物2和5-FU的半数抑制浓度（IC50 ）。各组HepG2细
                                                           胞增殖抑制率测定结果详见表1。
                                                           表 1   各组 HepG2 细胞增殖抑制率测定结果（x±±s，
                                                                 n＝5）
                A.代谢物1                    B.代谢物2
                                                           Tab 1 Determination result of proliferation inhibito-
                    图3 代谢物1和2的结构式
                                                                  ry rate of HepG2 cells in each group（x ±± s，
           Fig 3 Structural formula of metabolites 1 and 2
                                                                  n＝5）
            代 谢 物 2：淡 黄 色 无 定 形 粉 末 ，易 溶 于 甲 醇 和
                                                           组别                 给药浓度，μg/mL        增殖抑制率，％
                                      +
                                                   －
        DMSO。ESI-MS m/z：447.09[M+H] ，445.11[M-H] ，分        空白对照组                  0                0
                                              MeOH
        子式为 C21H18O11。熔点：195～197 ℃。UV λ       max nm（log   5-FU组                 30             90.886±1.003 ＊＊
                                                           代谢物2低质量浓度组            45             23.154±4.561 ＊
                              λ MeOH+NaOAc nm（logε）：267（4.35），
                                                           代谢物2中质量浓度组            90             50.226±1.142
        ε）：271（4.33），318（4.01）； max                                                                   ＊＊
                 λ MeOH+AlCl 3 nm（logε）：254（3.98），282（4.31），334  代谢物2高质量浓度组      180            62.049±0.566 ＊＊
        362（3.99）； max
                                                                               ＊
                                                                                      ＊＊
                               －1
                                             －1
       （4.36）。IR（KBr）：3 370 cm （OH），1 739 cm （COOH），           注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
                                                                                          ＊＊
                                                                                   ＊
                － 1
        1 657 cm （共 轭 C＝O），1 626cm （芳 香 C＝C）。                  Note：vs. blank control group，P＜0.05， P＜0.01
                                        － 1
        1 H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.01（1H，d，J＝7.5），            由表1可知，与空白对照组比较，5-FU组和代谢物2
        6.67（1H，s，C8-H），6.97（1H，s，C3-H），7.61（3H，m，C3′，     低、中、高质量浓度组细胞增殖抑制率均显著升高（P＜
        4′，5′-H），8.05（2H，m，C2′，6′-H），10.62（1H，s，           0.05 或 P＜0.01），表明代谢物 2 对 HepG2 细胞具有显著
        C7-OH），13.03（1H，s，C5-OH）。 C-NMR（100 MHz，           的增殖抑制作用。根据概率法计算得5-FU、代谢物2对
                                      13
        DMSO-d6 ）δ：163.3（C-2），104.2（C-3），182.2（C-4），153.0  HepG2细胞的IC50分别为30、90 µg/mL。
       （C-5），128.0（C-6），157.5（C-7），94.4（C-8），152.5（C-9），   2.3.2  高内涵细胞成像分析法分析代谢物 2 对 HepG2
        104.5（C-10），130.7（C-1′），126.4（C-2′6′），129.1（C-3′   细胞增殖的影响          取对数生长期的 HepG2 细胞，以 1×
                                                             4
        5′），132.0（C-4′），103.6（C-1‴），73.5（C-2‴），76.0（C-3‴），  10 个/mL 的密度接种于多聚赖氨酸包被的 96 孔板，将
        71.2（C-4‴），75.6（C-5‴），170.1（C-6‴）。上述数据与文献          细胞分为空白对照组和代谢物 2 低、中、高质量浓度组
            [15]
        方法 报道一致，故推测代谢物 2 为黄芩素 6-O-β-D-葡                    （45、90、180 µg/mL），每组设3个复孔，常规培养24 h后，
        萄糖醛酸苷，其结构式详见图3B。                                   分别加入对应浓度的含药培养基培养 24 h。于培养结
        2.3  代谢物2对HepG2细胞增殖的影响考察                           束前 0.5 h，取出 96 孔板，轻轻移去上清液，每个孔加入
            已有研究证实代谢物 1（千层纸素 A-7-O-β-D-葡萄                  60 µL 活细胞染液（包括 Bobo-3 膜通透性染料、DAPI 核
        糖醛酸苷）与黄芩苷具有相似的药理活性 ，但笔者未                           染料和线粒体绿色荧光探针），继续培养0.5 h进行染色；
                                            [16]
        见国内外有关代谢物2（黄芩素6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）                      染色后吸弃染液，加入 100 µL/孔的 4％多聚甲醛固定
        的药理活性报道。基于此，笔者使用 MTT 法和高内涵                         液，室温放置20 min进行固定；再吸弃固定液，使用清洗
        细胞成像分析法考察了代谢物 2 对 HepG2 细胞增殖的                      液100 µL/孔清洗后吸弃，加入100 µL/孔的透化液，室温
        影响。                                                避光孵化 20 min 进行透化；然后吸弃透化液，用清洗液
        2.3.1  MTT 法检测代谢物 2 对 HepG2 细胞增殖的影                 清洗3次后，加入100 µL/孔的封闭液，室温培养20 min；
        响   参考相关文献方法 ，取对数生长期的 HepG2 细                      吸弃封闭液，用清洗液清洗3次后，加入高内涵细胞成像
                             [17]
        胞，以 5×10 个/200 µL 的密度接种于 96 孔板，将细胞分                分析系统。设置系统激发/光发射波长为 358/461 nm 检
                  3
        为代谢物 2 低、中、高质量浓度组（45、90、180 µg/mL）和                测 DAPI 染色的核通道，570/603 nm 检测膜通透性，490/
        空白对照组（等体积不含药的 DMEM 培养基）、5-FU 组                     516 nm检测线粒体分布，观察代谢物2对HepG2细胞数
       （阳性对照，30 µg/mL），每组设 5 个复孔，常规培养 24 h                 量的影响，并记录细胞核面积变化、线粒体分布[用荧光
        后，再换用无血清的 DMEM 培养基继续培养 24 h 使细                     强度值（F）表示，数值越大表示线粒体分布越广]和 Bo-
        胞同步化；分别加入对应浓度的药物孵育 24 h；吸弃培                        bo-3 膜通透性（用 F 值表示，数值越大表示膜通透性越


        中国药房    2020年第31卷第7期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7  ·803  ·
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