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醛麻醉大鼠，行胆管插管 。待大鼠清醒后，灌胃给予                            动相为0.03％三氟乙酸水溶液-甲醇-乙腈溶液（66∶21∶13，
                              [14]
        黄芩苷溶液[168 mg/kg，根据黄芩苷在茵栀黄软胶囊（主                      V/V/V）；流速为3 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为275
        要活性成分为黄芩苷）中的用量换算而得]。持续收集                            nm；进样量为40 µL。
        大鼠24 h的胆汁，作为胆汁样品1，备用。取100 μL大鼠                      2.2.2  黄芩苷代谢物的分离纯化             取 5 只大鼠，经水合
        胆汁样品 1 于 5 mL 的离心管中，加入 0.5 mol/L 盐酸溶                氯醛麻醉后，同“2.1.3”项下方法麻醉、插管，待大鼠清醒
        液 50 μL，涡旋混合 30 s，加入乙酸乙酯 2 mL，振荡 10                 后，灌胃给予黄芩苷溶液（400 mg/kg，根据前期实验中大
        min进行萃取，在4 ℃下以4 000 r/min离心10 min后，取                鼠的最大耐受剂量换算而得，为增加胆汁中代谢物含量
        上清液于 40 ℃下氮气吹干，加甲醇 100 μL 复溶，再在                     所以增加了灌胃剂量）。持续收集大鼠 48 h 的胆汁，作
        4 ℃下以12 000 r/min离心10 min后，取上清液，备用。                 为胆汁样品 2，于－20 ℃储存，备用。每次取 100 µL 胆
        2.1.4  黄芩苷胆汁代谢物初步分析              取大鼠空白胆汁、           汁样品 2，加入 0.5 mol/L 盐酸 50 µL 涡旋混合 40 s，再加
        大鼠空白胆汁+黄芩苷对照品、大鼠灌胃给药后的胆汁                            2 mL 乙酸乙酯，振荡萃取 10 min 后，在 4 ℃下以 4 000
        各适量，按“2.1.3”项下方法处理后，再按“2.1.1”项下色                    r/min离心10 min，取上清液于氮气下吹干。重复上述操
        谱条件进样分析。结果，黄芩苷经过胆汁代谢后，除原                            作，将所有胆汁样品富集，最后得到粗品 78.59 mg。将
        型外，主要产生 2 个代谢物（分别为代谢物 1 和代谢物                        富集得到的粗品用一定量甲醇稀释成质量浓度为19.64
                                                            mg/mL的溶液，再以12 000 r/min离心10 min后，取上清
        2），其中黄芩苷、代谢物1与代谢物2的保留时间分别为
                                                            液 40 µL，按“2.2.1”项下色谱条件进行分离纯化。试验
        8.0、11.2、13.4 min，色谱图详见图1。
                                                            过程中一直将收集馏分的容器置于冰水浴中保持化合
            140                                             物的稳定，再将收集的馏分混合，使用旋转蒸发仪将溶
            120
            100                                             剂挥干，得到代谢物 1（保留时间为 37.5 min）8.51 mg、
           mAU  80                                          代谢物 2（保留时间为 44 min）11.52 mg。半制备型高效
            60
            40                                              液相色谱图详见图2。
            20
             0
              0    2     4    6     8    10   12   14
                                                               1 500
                                t，min
                             A.大鼠空白胆汁                          1 000
                                                              mAU
            180                    黄芩苷                          500
            160                                                                  黄芩苷           代谢物1  代谢物2
            140
            120                                                  0  0  5  10  15  20  25  30  35  40  45
           mAU  100                                                                t，min
            80
            60                                                        图2   半制备型高效液相色谱图
            40
            20                                                 Fig 2  Semi-preparative HPLC chromatograms
             0
              0    2     4    6     8    10   12    14
                                t，min                       2.2.3  黄 芩 苷 代 谢 物 的 结 构 鉴 定      采 用 紫 外 光 谱
                         B.大鼠空白胆汁+黄芩苷对照品
                                                           （UV）、IR、MS、NMR技术并结合其理化性质对黄芩苷代
            600                                             谢物1、2进行鉴定，结果如下。
                                            代谢物1
            500
                                                                代 谢 物 1：淡 黄 色 无 定 形 粉 末 ，易 溶 于 甲 醇 和
            400
                                                                                           +
                                                                                                       －
           mAU  300                             代谢物2        DMSO。ESI-MS m/z：461.08[M+H] ，459.31[M-H] ，分
            200                    黄芩苷                                                            MeOH
                                                            子式为 C22H20O11。熔点：192～194 ℃。UV λ       max nm（log
            100
                                                            ε）：245 sh（4.02），272（4.41），310（4.17）；没有观察到代
             0
              0    2     4    6     8    10   12    14
                                                                                        λ
                                                                                         MeOH+AlCl 3
                                t，min                       谢物 1 的 NaOAc 紫外光谱变化； max           nm（log ε）：251
                         C.大鼠灌胃给药后的胆汁样品溶液
                                                            sh（4.01），283（4.39），331（4.23）。IR（KBr）：3 455 cm －1
                       图1 高效液相色谱图
                                                                          － 1
                                                                                             － 1
                                                           （OH），1 735 cm （COOH），1 657 cm （共轭 C＝O），
                   Fig 1 HPLC chromatograms
                                                                                    1
                                                                    － 1
                                                            1 613 cm （芳香 C＝C）。 H-NMR（400 MHz，DMSO-
        2.2 大鼠胆汁中黄芩苷代谢物的分离纯化及鉴定                             d6）δ：3.77（3H，s，C6-OCH3），5.35（1H，d，J＝7.0），7.07
            本研究在前期试验基础上建立半制备型高效液相                          （1H，s，C3-H），7.12（1H，s，C8-H），7.59（3H，m，C3′，4′，
        色谱法进行黄芩苷代谢物的分离纯化。                                   5′- H），8.01（2H，m，C2′，6′-H），12.82（1H，s，
        2.2.1  色谱条件       色谱柱为 Agilent ZORBAX SB-C18        C5-OH）。 C-NMR（100 MHz，DMSO-d6 ） δ ：163.6
                                                                      13
        （250 mm ×9.4 mm，5 µm）半制备型高效液相色谱柱；流                 （C-2），104.8（C-3），182.3（C-4），152.6（C-5），132.6
        ·802  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 7                                   中国药房    2020年第31卷第7期
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