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显示，该杂质分子量为 159，推测其为奥拉西坦在酸、碱 99.5％（n＝6）。经 H-NMR（400 MHz，D2O）分析，结果
1
作用下水解生成的奥拉西坦酸。 显示，δ：4.40（m，1H），4.14（d，2H，J＝17.6 Hz），3.92（dd，
100 1H，J＝17.6 Hz，6.5 Hz），3.42（dd，1H，J＝10.4 Hz，1.9
奥拉西坦
75 Hz），2.87（dd，1H，J＝17.2 Hz，6.4 Hz），2.28（dd，1H，J＝
mAU 50 未知杂质 17.2 Hz，2.0 Hz）。
25 2.3 奥拉西坦胶囊中奥拉西坦酸的含量测定
0 采用HPLC法进行含量测定。
2.3.1 色谱条件 采用“2.1.1（1）”项下色谱条件。
5 10 15 20 25 30
t，min 2.3.2 溶液的制备 （1）供试品溶液：按“2.1.2（1）”项下
图2 一维液相色谱图 方法配制，即得。（2）自身对照溶液：取上述供试品溶液
Fig 2 One-dimensional liquid chromatogram 按“2.1.2（2）”项下方法配制，即得。（3）杂质对照品溶液：

6.0×10 7 6.0×10 5 精密称取“2.2.1”项下奥拉西坦酸精制品 25 mg，置于 25
5.0×10 7 5.0×10 5 mL量瓶中，加0.02 mol/L磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至
cps 4.0×10 7 cps 4.0×10 5
intensity， 3.0×10 7 7 intensity， 3.0×10 5 5 刻度，摇匀，作为贮备液；临用前取该贮备液 0.5 mL，置
2.0×10
2.0×10
1.0×10 7 1.0×10 5 于100 mL量瓶中，加0.02 mol/L磷酸二氢钠溶液溶解并
0 0 稀释至刻度，摇匀，即得。（4）空白辅料溶液；取胶囊辅料
2 4 6 8 10 12 14 60 80 100 120 140 160 180 200 （本课题组根据各厂家处方自行配制）按照处方比例混
t，min m/z
A.总离子流图 B.未知杂质质谱图 合，精密称取适量，加0.02 mol/L磷酸二氢钠溶液溶解制
图3 总离子流图及未知杂质质谱图（MS 模式） 成空白辅料溶液。
+
Fig 3 Total ion and MS chromatograms of unknown 2.3.3 系统适用性试验 称取“2.2.1”项下奥拉西坦酸
+
impurity（MS mode） 精制品适量，加入“2.3.2（2）”项下自身对照溶液适量，
加 0.02 mol/L 磷酸二氢钠溶液稀释制成含奥拉西坦 1
2.5×10 7
6.0×10 5
2.0×10 7 cps 5.0×10 5 μg/mL、奥拉西坦酸 5 μg/mL 的混合溶液，再按“2.1.1
cps 1.5×10 7 4.0×10 5 （1）”项下色谱条件进样测定；另取“2.3.2（1）（3）（4）”项
intensity， 1.0×10 7 6 intensity， 3.0×10 5 5 下供试品溶液、杂质对照品溶液、空白辅料溶液同法进
2.0×10
5.0×10
0 1.0×10 5 样测定，记录色谱图，详见图 5。结果显示，奥拉西坦和
2 4 6 8 10 12 14 60 80 100 120 140 160 180 200
t，min m/z 奥拉西坦酸分离度大于 4.6，理论板数按奥拉西坦峰计
A.总离子流图 B.未知杂质质谱图 不低于5 000，空白辅料无干扰。
－
图4 总离子流图及未知杂质的质谱图（MS 模式） 400
100
Fig 4 Total ion and MS chromatograms of unknown 300 75
impurity（MS mode） mAU 200 mAU 50
－
100 25
2.2 杂质奥拉西坦酸的制备纯化、标化及结构确证 0 0
[9]
2.2.1 杂质奥拉西坦酸的制备纯化 参考文献方法 进 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30
t，min t，min
行制备与纯化。取奥拉西坦原料药20 g，置于500 mL回 A.奥拉西坦和奥拉西坦酸混合溶液 B.供试品溶液
流瓶中，加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液100 mL，搅拌使溶 750 100
75
解，加热保温回流反应 5 h 后停止；冰浴降温至 0 ℃后， mAU 500 mAU 50
用1 mol/L盐酸溶液调节pH为4，在50 ℃条件下蒸发至 250 25
0 0
近干后，采用Sep-Pak Silica固相萃取小柱层析，以二氯
®
5 10 15 5 10 15 20 25 30
甲烷和甲醇梯度洗脱；收集洗脱液，在30 ℃条件下蒸发 t，min t，min
至干，得黄色油状物。取该油状物，加入 90％甲醇 50 C.杂质对照品溶液 D.空白辅料溶液
图5 高效液相色谱图
mL 后，在 60 ℃条件下加热使溶解，趁热过滤；滤液于
0 ℃条件下放置过夜，析出结晶后滤过；结晶以甲醇清洗 Fig 5 HPLC chromatograms
后，在 60 ℃条件下干燥，得白色固体，即得杂质奥拉西 2.3.4 检出限和定量限考察 取“2.3.2（3）”项下杂质对
坦酸精制品。 照品溶液，以 0.02 mol/L 磷酸二氢钠溶液为溶剂逐级稀
2.2.2 奥拉西坦酸的标化及结构确证 取“2.2.1”项下 释制得系列溶液，按“2.1.1（1）”项下色谱条件进样测
制备纯化所得的奥拉西坦酸精制品适量，加 0.02 mol/L 定。结果，当信噪比分别为3 ∶ 1、10 ∶ 1时，得奥拉西坦酸
磷酸二氢钠溶液溶解制成每1 mL中含奥拉西坦酸1 mg 的检出限为0.02 ng、定量限为0.1 ng。
的溶液，再按“2.1.1（1）”项下色谱条件进样测定。采用 2.3.5 线性关系考察 取“2.3.2（2）（3）”项下自身对照
峰面积归一化计算，结果所制奥拉西坦酸的含量为 溶液和杂质对照品溶液，按“2.1.1（1）”项下色谱条件分

·684 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6 中国药房 2020年第31卷第6期