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物溶液。                                               2.6 抑制类型判断
        2.3.2  酶溶液    称取 XO 适量，用水 1 mL 溶解，得浓度                  采用Graphpad prism 6.0软件、使用双倒数法绘图以
        为 100 U/mL 的 XO 贮备液；将上述贮备液以每管 50 μL                进行酶抑制类型的判断 。在 5 个剂量黄嘌呤底物
                                                                                  [18]
        分装至10 mL EPP管中，于－80 ℃冰箱中保存。取上述                     （1 200、1 000、800、600、400 μmol/L，反应终浓度分别为
        贮备液适量，用 PBS 稀释，制得浓度为 0.2 U/mL 的 XO                 300、250、200、150、100 μmol/L）以及 2 个剂量别嘌醇
        溶液。溶液配制完毕后，立即置于0 ℃冰箱中保存。                           （250、125 μmol/L，反应终浓度分别为62.5、31.25 μmol/L）、
        2.3.3  对照溶液      精密称取别嘌醇适量，用 DMSO 溶                活性提取物（1 000、500 μmol/L，反应终浓度分别为250、
        解，加PBS适量稀释，制得质量浓度为500 μg/mL的别嘌                     125 μmol/L）的分别作用下，按“2.4”项下方法检测。以
        醇母液，待用。采用二倍稀释法，以含 DMSO 的 PBS 为                     OD 值 20 min 内变化速率[即（OD20 min－OD0 min ）/20]的倒
                                                                                                  5
        溶剂将上述母液逐级稀释，制得质量浓度分别为 500、                         数（1/v）为因变量、黄嘌呤底物浓度倒数的 10 倍[（1/c）×
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        250、125、62.5、31.3、15.63、7.82、3.91 μg/mL 的对照溶       10 ]为自变量绘制双倒数方程曲线，观察不同抑制剂浓
        液，DMSO含量为1％。                                       度下两条曲线的交叉情况。若两条曲线相交于纵轴，为
        2.3.4  样品溶液     ①9 种中药提取物样品溶液：分别称                  竞争性抑制；若相交于横轴，为非竞争性抑制；若相互平
        取“2.1”项下各中药提取物的干燥浸膏适量，研碎，精                         行无交叉，为反竞争性抑制；若相交于第2象限，为竞争-
        密称定，用 DMSO 溶解，再用 PBS 稀释，制得质量浓度                     非竞争性抑制；若相交于第 3 象限，为非竞争-反竞争性
                                                               [18]
        均为 2 000 μg/mL（以干燥浸膏质量计，下同）的提取物                    抑制 。
        样品母液。采用二倍稀释法，以含DMSO的PBS为溶剂                         3 结果
        将上述母液逐级稀释，制得质量浓度分别均为 2 000、                        3.1 9种中药提取物XO抑制活性的初筛结果
        1 000、500、250、125、62.5、31.3 μ g/mL 的 样 品 溶 液 ，         在相同终浓度条件下，9 种中药共 18 个提取物对
        DMSO 含量为 1％。②活性提取物各萃取部位样品溶                         XO 的抑制率及 IC50值见表 2。由表 2 可见，各中药提取
        液：分别称取“2.2”项下各活性提取物萃取部位浸膏适                         物对 XO 的抑制率均有随剂量降低而下降的趋势，其中
        量，研碎，精密称定，用DMSO溶解，再用PBS稀释，制得                       500 μg/mL 各中药提取物（除石胡椒醇提物超出限度
        质量浓度为1 000 μg/mL的萃取部位样品母液。采用二                      外），250 μg/mL 三角风、石胡椒、山莓、爬岩香的水提物
        倍稀释法，以含DMSO的PBS为溶剂将上述母液逐级稀                         和醇提物，250 μg/mL 梓木皮水提物，250 μg/mL 金雀花
        释，制得质量浓度分别均为 1 000、500、250、125、62.5、               根、牛迭肚根、凌霄花根醇提物，125 μg/mL金雀花根、牛
        31.3、15.6 μg/mL的样品溶液，DMSO含量为1％。                    迭肚根醇提物以及62.5 μg/mL金雀花根醇提物对XO的
        2.4  XO抑制活性的检测                                     抑制率均超过了50％。当提取物剂量为62.5 μg/mL时，
            在适宜条件下，黄嘌呤会被XO催化生成尿酸，尿酸                        超半数提取物对XO的抑制率低于或接近10％，且爬岩
                                   [16]
        在290 nm波长处有特征吸收峰 。基于此，本研究采用                        香水提物的抑制率低至 1.0％；当提取物剂量≤31.25
        Vikrama Chakravarthi P等 报道的紫外分光光度法进行               μg/mL 时，除金雀花根醇提物（31.25 μg/mL）对 XO 的抑
                              [16]
        XO 抑制活性的检测。反应体系总体积为 200 μL，将                       制率为 48.3％外，其余提取物对 XO 的抑制率均已降至
       “2.3.4”项下的样品溶液（或“2.3.3”项下的对照溶液，反                    10％以下。在 18 个提取物中，金雀花根醇提物的 IC50
        应终浓度均较原样品稀释4倍）50 μL和酶溶液（反应终                        （43.43 μg/mL）虽高于阳性对照别嘌醇（5.11 μg/mL），但
        浓度为 0.05 U/mL）50 μL 混合后，于 25 ℃预温育 15               明显低于其余药材的提取物，表明金雀花根醇提物活性
        min，加入底物溶液（反应终浓度为150 μmol/L）50 μL以                 相对较强，故以其为活性提取物进行后续试验。
        启动反应，于25 ℃温育20 min后，加入1 mol/L HCl溶液                3.2  金雀花根醇提物 XO 抑制活性萃取部位的筛选
        50 μL 以终止反应。取上述反应液适量，使用全波长扫                        结果
        描式多功能读数仪于290 nm波长处检测各反应液的光                             活性提取物金雀花根醇提物不同萃取部位对XO的
        密度（OD）值，取该值与温育 0 min 时 OD 值的差值作为                   体外抑制活性检测结果见图 1、表 3。由图 1、表 3 可见，
        检测结果。每样品平行操作 3 次，试验重复 2 次。同法                       EA、NB、DCM 部位对 XO 的抑制率有随剂量增加而降
        检测空白样品（即不含受试提取物，以含 1％DMSO 的                        低的趋势。其中，EA 部位的 IC50值为 7.67 μg/mL，接近
        PBS 替代样品溶液，以测定酶的最大反应活性）的 OD                        于别嘌醇的 5.11 μg/mL，活性最强；NB 部位的 IC50值为
        值，并计算抑制率，抑制率（％）＝（1－试验样品平均OD                        14.80 μg/mL，活性次之；DCM 部位的 IC50 值为 193.35
                                   [17]
        值/空白样品平均OD值）×100％ 。                                μg/mL，活性相对较弱；而 W、PE 部位的 IC50 值均大于
        2.5 IC50的计算                                        200 μg/mL，无活性。
            采用 Graphpad prism 6.0 软件进行数据分析。以提              3.3 金雀花根醇提物酶抑制类型分析
        取物（或别嘌醇）的（质量）浓度（c）的对数为横坐标、其                            在不同抑制剂浓度下，别嘌醇的两条曲线相交于纵
        相对应的 OD 值为纵坐标进行线性拟合，计算半数 XO                        轴，属于竞争性抑制；而金雀花根醇提物的两条曲线相
        被抑制时的药物浓度，即IC50。                                   交于第2象限，属于竞争-非竞争性抑制，详见图2。


        中国药房    2020年第31卷第6期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6  ·679  ·
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