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80％乙醇洗脱，得桑叶总黄酮[经紫外分光光度法以紫                          TAGCAT-3′、5′-AGCTACGTACGTAGCTAGCT-3′，β-actin
        外分光光度计测得其含总黄酮含量为 58.7 g/L（以生药                      上、下游引物分别为 5′-CGATGCTAGCTAGCTACGAT-
        量计）]，于4 ℃保存，备用。                                    3′、5′-ATGCTAGCTAGCTAGCATGC-3′。反应条件：95 ℃
        2.2 GDM模型制备                                        预变性 3 min，95 ℃变性 30 s，30 ℃退火 30 s，72 ℃延伸
            雌性SD 大鼠连续喂养高脂饲料8 周后，禁食、不禁                      60 s，共 35 个循环。使用 Bio-Rad iQ5 V2.1.97 软件绘制
        水 12 h，以血糖仪测定其空腹血糖（FBG）水平，剔除                       循环曲线并计算循环阈值（Ct，即每个样品的荧光信号
        FBG≥6.67 mmol 者；剩余雌性 SD 大鼠按 2 ∶ 1 的比例与             到达设定阈值时所经历的循环数）；并以β-actin为内参，
        雄性大鼠合笼，次日经阴道涂片镜检，发现有精子的雌                           按2  －ΔΔCt 法计算PPARγ、NF-κB、AMPK mRNA的表达量。
        性 SD 大鼠即认定为妊娠，并记为孕第 0 天（G0 d ）。妊娠                  2.7 PPARγ、NF-κB、p-AMPK蛋白表达检测
        大鼠禁食、不禁水12 h后，单次腹腔注射STZ（25 mg/kg）                      采用 Western blotting 法。取“2.4”项下胎盘组织适
        以复制 GDM 模型，于 G3 d 同法检测其 FBG 水平，若为                  量，剪碎后加入 RIPA 裂解液，充分裂解后，于 4 ℃下以
                                                  [10]
        6.67～16.67 mmol/L则判定为GDM模型复制成功 。                   12 000 r/min 离心 15 min，收集上清液后以 BCA 蛋白定
        2.3 分组与给药                                          量试剂盒测定总蛋白含量。取蛋白 30 μg，与上样缓冲
            将妊娠大鼠随机分为对照组、GDM 组以及桑叶总                        液混合后，行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
        黄酮低、中、高剂量组，每组10只。对照组大鼠予高脂饲                         （SDS-PAGE），并于电泳后转移至硝酸纤维素酶（NC）膜
        料并于 G0 d时腹腔注射等剂量枸橼酸缓冲液；其余各组                        上，以5％脱脂牛奶室温封闭2 h，加入相应一抗（PPARγ、
        大鼠按“2.2”项下方法复制GDM模型，并于STZ注射后                       NF-κB、AMPK、p-AMPK 的稀释度均为 1 ∶ 1 000，β-actin
                                         [7]
        灌胃相应药物，给药剂量参考穆晓燕等 的研究，低、中、                         的稀释度为1∶5 000），于4 ℃孵育过夜；用三羟甲基氨基
        高剂量分别为50、100、200 mg/kg（以桑叶总黄酮提取物
                                                           甲烷盐酸盐（TBST）溶液清洗 10 min×3 次，加入相应二
        质量计）；对照组和 GDM 组大鼠分别灌胃生理盐水（10
                                                           抗（稀释度为1 ∶ 2 000），室温孵育1 h；用TBST溶液清洗
        mL/kg）；每日1次，连续18 d。分别于G3 d、G7 d、G18 d时，空
                                                           10 min×3次，以ECL化学发光试剂显色后置于蛋白电泳
        腹采集尾尖血，采用血糖仪测定其FBG水平。                              系统及凝胶成像仪上成像，使用 Image J v1.8.0 软件处
        2.4  标本采集
                                                           理，以PPARγ、NF-κB与内参β-actin条带灰度值的比值作
            于 G18 d测定 FBG 水平后，腹腔注射 3％戊巴比妥钠
                                                           为 PPARγ、NF-κB 蛋白的表达量，以 p-AMPK 与 AMPK
        溶液进行麻醉，经大鼠心脏取血，以 3 000 r/min 离心 15
                                                           条带灰度值的比值作为p-AMPK蛋白的表达量。
        min，分离血清，置于－80 ℃冰箱中保存，备用；采血后
                                                           2.8  统计学方法
        处死各组大鼠，取胎盘组织适量，经生理盐水反复清洗
                                                               采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
        后，放入液氮中短暂冻存 20～30 min，随后置于－80 ℃
                                                           料均以x±s表示，经Levene法检验后，方差齐的数据的
        冰箱中保存，备用。
        2.5  血清指标检测                                        多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
                                                           LSD-t 检验；方差不齐的组间比较采用非参数秩和检
            取“2.4”项下血清适量，采用全自动生化分析仪检测
                                                           验。P＜0.05为差异有统计学意义。
        各组大鼠血清中三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度
        脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）                     3 结果
                                                           3.1  各组大鼠糖脂代谢指标比较
        的水平，采用试剂盒检测各组大鼠血清中 TNF-α、IL-6、
        IL-8、MDA、SOD、GSH、CAT的水平，均严格按照试剂盒                       G0 d时，各组大鼠 FBG 水平组间比较差异均无统计
        说明书方法操作。                                           学意义（P＞0.05）。与对照组比较，GDM组大鼠G3 d、G7 d、
        2.6 PPARγ、NF-κB、AMPK mRNA表达检测                      G18 d时的FBG水平均显著升高（P＜0.01）。与GDM组比
            采用荧光定量 PCR 法。取“2.4”项下胎盘组织适                     较，桑叶总黄酮中、高剂量组大鼠G3 d、G7 d、G18 d时的FBG
        量，剪碎后采用超纯 RNA 提取试剂盒分离组织中的总                         水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；而桑叶总黄酮低
        RNA，采用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒将RNA反                    剂量组大鼠上述时间点 FBG 水平与 GDM 组比较，差异
        转录为cDNA，使用UltraSYBR Mixture试剂盒配制反应                 均无统计学意义（P＞0.05），详见表1。
        体系（共20 μL），即cDNA模板1 μL，试剂盒内的反应混                        G18 d 时，与对照组比较，GDM 组大鼠血清中 TG、
        合液10 μL，5 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，去离子水                TC、LDL-C 水平均显著升高（P＜0.01）；而 HDL-C 水平
        8 μL。引物序列：PPARγ上、下游引物分别为 5′-ATGC-                  与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与 GDM
        TATAGTCTATGCTACT-3′、5′-GCTAGCTAGTAGCTAG-           组比较，桑叶总黄酮中、高剂量组大鼠血清中 TG、TC、
        CTGA-3′，NF-κB上、下游引物分别为5′-TAGCGATTAG-               LDL-C水平均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；而桑叶总
        CTTACGTAG-3′、5′-TAGCTAGCTAGCTACGTAC-3′，            黄酮低剂量组 TG、TC、LDL-C 以及各给药组 HDL-C 水
        AMPK 上、下游引物分别为 5′-GCTAGCTAGCTAGC-                  平与 GDM 组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），详


        中国药房    2020年第31卷第6期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6  ·673  ·
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