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直径＜10 mm，无抑菌作用；10 mm，轻度敏感；11～15                    （DDA）；扫描范围为m/z 350～1 550。
                                      [7]
        mm，中度敏感；≥16 mm，高度敏感 。                               2.3.4  生物学功能分析         使用 PEAKS Q 8.5 软件（加
                                                                                              ®
        2.2.2  最小抑菌浓度（MIC）测定           采用琼脂倍比稀释             拿大BSI公司）对蛋白及肽段进行定量并对定量值作归
          [7]
        法 。精密称取“2.2.1”项下具有抗菌活性的萃取部位适                        一化处理，取中位数作为平均数。筛选药物组和对照组
        量，用 MH 琼脂培养基稀释，制成质量浓度分别为 12.5、                      蛋白表达量（即对应肽段的信号强度）差异倍数＞2.0且
        6.25、3.125、1.562 5、0.781 3、0.39、0.195、0.097 6 mg/mL  P＜0.01 的蛋白作为差异表达蛋白。采用 Blast 2 GO 在
        的含药平皿。同时，以无菌生理盐水配制 0.5 麦氏浊度                         线软件（https：//www.blast2go.com/）对差异表达蛋白进
        单位的病原菌菌悬液，再用无菌生理盐水稀释至含菌量                            行GO蛋白质功能注释，并选取蛋白表达量高且P＜0.05
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        1×10 CFU/mL，取上述菌悬液 5 μL，于 10 min 内接种于               的前10位生物信息绘制Bar图；使用KOBAS 3.0在线工
        MH琼脂培养基中，于37 ℃、5％CO2条件下培养18 h后                      具（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）对差异表达蛋白进行
        观察结果，以平皿表面光滑且未见菌落生长时对应的质                            KEGG信号通路富集分析，以P＜0.05为显著富集，并对

        量浓度作为该萃取部位的MIC。                                     富集通路进行注释和分析。
                                           [8]
        2.2.3  细菌生长曲线绘制          采用比浊法 。取对数生长               3 结果
        期多重耐药金黄色葡萄球菌适量，用 LB 培养基稀释至                          3.1 香青兰提取物抑菌活性部位筛选结果
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        1×10 CFU/mL，加入“2.2.1”项下具有抗菌活性的萃取部                       抑菌圈检测结果显示，香青兰石油醚、二氯甲烷、乙
        位适量，使其最终质量浓度分别为MIC的0.5、1、2倍，并                       酸乙酯、正丁醇等4个提取部位对肺炎克雷伯菌、大肠埃
        设置未经萃取部位处理的菌悬液作为空白对照，于                              希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等4种革兰氏阴性杆
        37 ℃恒温振荡器上以 180 r/min 培养，每 2 h 取样 200 μ             菌均无明显的抑制作用；二氯甲烷部位对金黄色葡萄球
        L，用酶标仪于630 nm波长处检测光密度（OD）值，以培                       菌轻度敏感，乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、表皮葡
        养时间为横坐标、OD630 nm值为纵坐标，采用Excel 2016绘                 萄球菌、腐生葡萄球菌等革兰氏阳性球菌均具有不同程
                                                            度的抑制作用（抑菌圈直径为10～16 mm），为抑菌活性
        制多重耐药金黄色葡萄球菌的生长曲线。
        2.3  生物信息学分析                                        部位，故以乙酸乙酯部位作为后续试验的干预物。香青
                                                            兰提取物各萃取部位的抑菌圈直径见表1。
        2.3.1  蛋白提取      以 LB 培养基配制 0.6 麦氏浊度单位
                                                             表1    香青兰提取物各萃取部位的抑菌圈直径（mm）
        的多重耐药金黄色葡萄球菌菌悬液，再用 LB 培养基稀
                                                            Tab 1 Inhibition zone diameters of different extracts
        释10倍，将菌悬液随机分为药物组和对照组。其中，药
                                                                   of D. moldavica（mm）
        物组加入“2.2.1”项下具有抗菌活性的萃取部位供试溶
        液（250 mg/mL）适量，使其最终质量浓度为MIC的2倍；                     萃取部位    金黄色葡    表皮葡   腐生葡    人葡萄    溶血葡  金黄色葡萄球
                                                                     萄球菌    萄球菌   萄球菌    球菌     萄球菌  菌标准菌株
        对照组加入等体积DMSO，充分混匀，于37 ℃恒温振荡                         石油醚部位     0      0      0     0      0      0
        器上以 151 r/min 培养 24 h 后，以 3 000 r/min 离心 10         二氯甲烷部位    10     0      0     0      0     11
                                                            乙酸乙酯部位    16    11     10     12    13     11
        min，弃去上清液，沉淀用 PBS 清洗 2 mL×2 次后，于                    正丁醇部位     0      0      0     0      0      0
        －80 ℃保存并送至上海易算生物科技有限公司检测。                           3.2  香青兰提取物乙酸乙酯部位的MIC
        2.3.2  蛋白酶解     取各组蛋白样品，加入裂解液（含2％                       乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、
        SDS、7 mmol/L 尿素、1× Protease inhibitor cocktail，以水   人葡萄球菌的 MIC 均为 0.781 3 mg/mL，对腐生葡萄球
        为溶剂）适量，超声（功率：200 W，频率：53 kHz）处理 5                   菌的 MIC 为 0.390 7 mg/mL，对溶血葡萄球菌和金黄色
        min，冰上裂解 30 min，于 4 ℃下以 15 000 r/min 离心 15          葡萄球菌标准菌株的MIC均为1.562 5 mg/mL。
        min，收集上清液。                                          3.3 细菌生长曲线
        2.3.3  蛋白分析      取“2.3.2”项下上清液适量，采用纳升                   多重耐药金黄色葡萄球菌的生长曲线见图 1。在
        级 HPLC 系统进行分离，并采用质谱仪进行质谱分析。                         0～4 h 内，该菌生长处于迟缓期；培养 4 h 后，空白对照
        色谱条件：色谱柱为 Acclaim PepMap C18 （150 mm×7.5            组和 0.5 倍 MIC 组菌株进入对数生长期，并于 10 h 后进
        mm，3 μm）；流动相为水（A）-乙腈（含 0.1％甲酸，B），梯                  入稳定期；而1倍MIC组和2倍MIC组菌株增长缓慢，未
        度洗脱（0～120 min，3％B→32％B）；初始平衡时间为                     见明显的对数生长期。
        10 min；流速为 300 nL/min；柱温为 60 ℃；进样量为 10              3.4 差异表达蛋白分析
        μL。质谱条件：离子源为电喷雾离子源；离子源电压为                               共筛选出 300 个差异表达蛋白（P＜0.01），其中 239
        2 kV；毛细管温度为 320 ℃；扫描模式为数据依赖模式                       个表达上调、61个表达下调。


        ·668  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 6                                   中国药房    2020年第31卷第6期
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