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1 材料                                               96孔板中，培养24 h后，将细胞随机分为阴性对照组（有
        1.1 仪器                                             细胞组不含药，下同）和美洲大蠊提取物YS-A～H 不同
            SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限                     剂量组（均为 3、9、27、81 μg/mL，以各洗脱部位质量计，
        公司）；SERIESⅡ型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Sci-            剂量设置参考文献[9]），并设置不含细胞或药物的空白
        entific 公司）；CKX41SF 型倒置相差显微镜（日本 Olym-              对照组，每组设5个复孔。空白对照组和阴性对照组均
        pus 公司）；SN255939 型酶标仪（美国 BioTek 公司）；               加入完全培养基100 μL，各给药组加入含相应药物的完
        FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD公司）。                        全培养基 100 μL。培养 48 h 后，弃去上清液，每孔加入
        1.2 药材                                             5 mg/mL MTT 溶 液 20 μ L，继 续 孵 育 4 h；随 后 加 入
            美洲大蠊药材购自大理市金贝小区中药材市场（批                         DMSO 150 μL，使用酶标仪于 490 nm 波长处检测各孔
        号：150301），经大理大学昆虫生物医药研究院杨自忠教                       的 光 密 度（OD）值 ，并 计 算 各 部 位 的 半 数 抑 制 浓 度
        授鉴定为美洲大蠊（P. americana L.）的干燥虫体。                    （IC50 ）。根据上述结果，选取抑制作用最强（即 IC50值最
        1.3 试剂                                             小）的洗脱部位为活性部位，同法考察其作用 24、48、72
            RPMI 1640 培 养 基（批 号 ：1915379）、胎 牛 血 清          h时的细胞抑制率。抑制率（％）＝（阴性对照组平均OD
       （FBS，批号：1828728）均购自美国 Gibco 公司；胰蛋白                  值－试验组平均OD值）/（阴性对照组平均OD值－空白
        酶[密理博（中国）有限公司，批号：2046777]；MTT 试剂                   对照组平均OD值）×100％。上述试验重复3次（下同）。
       （批号：ST316）、二甲基亚砜（DMSO，细胞级，批号：RN-                    2.4 细胞凋亡情况检测
        BF1095）均购自美国 Sigma 公司；青-链霉素双抗（美国                       采用流式细胞术检测。取经胰蛋白酶消化的A549
                                                                       6
        Amersco 公司，批号：20180330）；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸                 细胞，以 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，将细
        荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）双染色法细胞凋                 胞随机分为阴性对照组和“2.3”项下筛选的美洲大蠊提
        亡检测试剂盒（批号：6033840）、PI染色法细胞周期检测                     取物活性部位不同剂量组（3、9、27、81 μg/mL，剂量设置
        试剂盒（批号：6209516）、JC-1染色法细胞线粒体膜电位                    参考“2.3”项），每组设 3 个复孔。阴性对照组加入完全
        检测试剂盒（批号：6113545）均购自美国 BD 公司；聚酰                    培养基2 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基2
        胺（30～60 目，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：                       mL。分别于培养的24、48、72 h时，收集细胞，按Annex-
        20120316）；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。                         in Ⅴ-FITC/PI 双染色法细胞凋亡检测试剂盒说明书进
        1.4  细胞                                            行染色，采用流式细胞仪检测各组凋亡早期、凋亡晚期
            人非小细胞肺癌细胞A549（批号：KCB200434YJ）购                 和坏死早期、坏死晚期细胞占细胞总数的百分比（以下
        自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。                             简称“细胞百分比”）。
        2 方法                                               2.5  细胞周期检测
        2.1  YS的制备                                             采用流式细胞术检测。取经胰蛋白酶消化的A549
                                                                       6
            美洲大蠊干燥虫体经粉碎后，用8倍量（g/mL）90％                     细胞，以 1×10 个/孔细胞接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，
        乙醇冷浸提取 3 次，每次 7 d，合并提取液，滤过，滤液浓                     按“2.4”项下方法分组、给药，每组设 3 个复孔。分别于
        缩至流浸膏，以石油醚脱脂，得脱脂流浸膏。取上述脱                           培养的 24、48、72 h 时，收集细胞，按 PI 染色法细胞周期
        脂流浸膏适量，经聚酰胺柱色谱，依次以水和 20％、                          检测试剂盒进行染色，采用流式细胞仪检测各组细胞周
        30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％甲醇洗脱，定量                 期，记录各周期细胞比例。
        收集流分并合并同一体积分数的甲醇洗脱部位，经浓缩                           2.6 细胞线粒体膜电位变化情况检测
        后冷冻干燥，依次得 YS-A～H 等 8 个洗脱部位，得率分                         采用流式细胞术检测。取经胰蛋白酶消化的A549
                                                                       6
        别为 9.926 4％、0.125 0％、0.097 8％、0.118 0％、0.100       细胞，以 1×10 个/孔细胞接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，
        7％、0.234 2％、0.137 2％、0.043 7％。                     按“2.4”项下方法分组、给药，每组设 3 个复孔。于培养
        2.2 细胞培养                                           48 h（培养时间根据前期研究确定，此时细胞密度最佳且
            A549 细胞经复苏后，接种于含 10％FBS、100 U/mL               形态较为一致）时，收集细胞，按JC-1染色法细胞线粒体
        青-链霉素双抗的RPMI 1640培养基（以下简称“完全培                      膜电位检测试剂盒说明书进行操作，使用流式细胞仪检
        养基”）中，于37 ℃、5％CO2条件下培养（培养条件下同）。                    测各组细胞线粒体膜电位的变化情况，并计算线粒体膜
        2.3  细胞增殖抑制率检测及活性部位筛选                              电位降低的细胞占细胞总数的百分比（即降低率）。
            采用 MTT 法检测。取对数生长期 A549 细胞，经胰                   2.7 统计学方法
        蛋白酶消化后，用完全培养基重悬，以5 000个/孔接种于                           采用 SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，采用


        中国药房    2020年第31卷第4期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 4  ·403  ·
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