Page 27 - 2020年2月第31卷第3期
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[14]
        改善机体免疫功能 、调控肠道菌群 等。长期以来，植                          2.2 指标测定
                                       [15]
        物多糖以其广泛的药效作用和极低的细胞毒性，在食                            2.2.1  多糖含量测定       按照标准DB12/T 884-2019 ，采
                                                                                                      [16]
        品、医药、化妆品和环境等领域具有广阔的应用范围。                           用蒽酮-硫酸法，以葡萄糖标准品为标准物质，测定FPSP
            前期有关伊贝母的研究主要集中在其生物碱类成                          中多糖含量。
                  [3]
        分的分析上 ，而有关其多糖成分的提取分离和结构鉴                           2.2.2  糖醛酸含量测定         按照标准 NY/T 2016-2011 ，
                                                                                                        [17]
        定及其相关生物活性的研究报道较少。已有研究表明，                           采用间羟基联苯法，以半乳糖醛酸标准品为标准物质，
                                           [6]
        多糖的生物活性与其化学结构密切相关 。因此，探究                           测定FPSP中糖醛酸含量。
        伊贝母中具有生物活性的多糖成分具有实际意义。本                            2.2.3  蛋白含量测定        采用二喹啉甲酸（BCA）法，按照
        研究采用 Box-Behnken 设计-响应面法优化伊贝母多糖                    蛋白测量试剂盒说明书进行操作，测定FPSP中蛋白含量。
       （FPSP）的提取工艺，利用紫外吸收光谱（UV）法、傅里叶                       2.3 提取工艺优化
        红外光谱（FTIR）法、气相色谱-质谱联用（GC-MS）法、刚                        根据Box-Behnken原理设计试验，选取料液比（A）、
        果红染色法、扫描电子显微镜（SEM）观察、X 射线衍射                        提取温度（B）、提取时间（C）3 个因素为自变量，以 FPSP
       （XRD）法及热化学分析等表征手段对FPSP进行结构初                         产率为响应值（Y），进行 3 因素 3 水平的响应面试验分
        探，为其多糖类生物大分子化合物的进一步开发提供理                           析，得到 FPSP 提取的适宜工艺参数，并利用 Design-Ex-
        论依据。                                               pert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，拟合响应值与
        1 材料                                               各因素的数学回归模型。因素与水平见表1。
        1.1 仪器                                                              表1 因素与水平
            FDU-2100型冷冻干燥机（日本Eyela 公司）；2550型                  Tab 1 Factors and levels of Box-Behnken design
        紫外分光光度计（日本 Shimadzu 公司）；CR22N 型高速                                               水平
                                                           因素
        冷冻离心机（日本Hitachi公司）；F-305型旋转蒸发仪（瑞                                  －1            0             1
                                                           A（g/mL）        1∶20          1∶30          1∶40
        士Buchi公司）；7890A-5975C型GC-MS仪（美国Agilent             B，℃            80            90            100
        公司）；NICOLET 6700 型 IR 仪（美国 Thermo Fisher Sci-      C，h             2            2.5            3
        entific公司）；SUPRA 55VP型SEM仪（德国Zeiss公司）；             2.4  FPSP的结构表征
        STA449F3型热分析仪（德国 Netzsch公司）；D8 Advance             2.4.1 UV 法    配制质量浓度为 1 mg/mL 的 FPSP 水溶
        型XRD仪（德国Bruker公司）。                                 液，用紫外分光光度计在 200～400 nm 波长范围内进行
        1.2  药品与试剂                                         全波长扫描。
            伊贝母于2016年6月采集于新疆伊犁，经新疆药物                       2.4.2 FTIR 法   取适量 FPSP，采用 KBr 压片法，用 IR
        研究所何江研究员鉴定为百合科贝母属植物伊贝母                             仪在4 000～400 cm 波数范围内进行分析。
                                                                            －1
       （Fritillaria pallidiflora Schrenk）的干燥鳞茎（标本保存        2.4.3 GC-MS 法    参考文献[6]所述方法，称取 5.0 mg
        在新疆药物研究所标本室，标本号为 81013）；蛋白测                        FPSP，溶解于4 mL的2 mol/L三氟乙酸中，置于GC顶空
        量 试剂盒（美国 Thermo Fisher Scientific 公司，批号：           进样瓶中，在鼓风干燥箱中以110 ℃条件密闭水解反应
        TH269579）；葡萄糖标准品（上海阿拉丁生化科技股份                       6 h。反应结束后，在酸水解的样品中加入5 mL甲醇，旋
        有限公司，批号：L1431014，分析纯）；半乳糖醛酸标准品                     蒸蒸干，重复3次，除掉剩余的三氟乙酸。在各单糖标准
       （上海纯优生物科技有限公司，批号：RT19U1015，纯                        品和酸水解完全的 FPSP 中分别加入 8 mg 盐酸羟胺及
        度：≥98％）；间羟基联苯（上海源叶生物科技有限公司，                        0.5 mL 吡啶，搅拌溶解后置于 90 ℃水浴中，反应 30
        批号：M23M8E32272，纯度：＞97％）；阿拉伯糖、木糖、                   min。取出冷却至室温，再加入 0.5 mL 乙酸酐，置于
        鼠李糖、半乳糖、甘露糖、蒽酮、硫酸、石油醚、氢氧化钠、                        90 ℃水浴中反应30 min后，氮吹仪吹干，加入1.0 mL氯
        乙酸酐、吡啶、盐酸羟胺、刚果红、甲醇、磷酸氢二钠、磷                         仿，产物用于GC-MS分析。GC-MS条件：毛细管色谱柱
        酸二氢钠及铁氰化钾等试剂均为国产分析纯或实验室                            为 OV-1701（30 cm×0.32 mm，0.25 μm），检测器为火焰
        常用规格；水为蒸馏水。                                        离子化检测器（FID），检测器温度为270 ℃，进样口温度
        2 方法                                               为 250 ℃，程序升温（起始温度为 160 ℃，以 5 ℃/min 升
        2.1 FPSP的提取                                        至 190 ℃，保持 5 min，同样速度升温至 230 ℃），载气为
            伊贝母干燥鳞茎经粉碎、过筛（40 目）后，用石油醚                      氮气，进样体积为1 μL。
        脱脂3次，得到的脱脂粉以水为溶剂在一定的料液比、提                          2.4.4  刚果红染色      参考文献[6]所述方法，配制质量浓
        取温度及提取时间条件下进行提取；过滤提取液，以                            度为 2 mg/mL 的 FPSP 水溶液和 0.2 mmol/L 的刚果红试
        6 462×g 离心 10 min（以下条件同），用旋转蒸发仪浓缩                  剂。分别量取 6 份 1 mL 的 FPSP 水溶液于离心管中，加
        上清液，再次离心；取滤液，加 4 倍体积的冰乙醇沉淀，                        入不同体积的1 mol/L的氢氧化钠溶液和水，摇匀，添加
        4 ℃放置 12 h，离心，冻干，得到 FPSP。以 FPSP 干质量/               1 mL 刚果红试剂，使溶液中氢氧化钠的最终浓度分别
        药材质量×100％计算产率（％）。                                  为 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05 mol/L。用紫外分光光度计


        中国药房    2020年第31卷第3期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 3  ·277  ·
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