Page 81 - 2020年1月第31卷第2期
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胰腺癌是一种早期诊断困难、进展迅速、预后极差                         为世纪生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液（北京普利
        的消化系统肿瘤，患者的 5 年生存率不到 10％ 。近年                       莱基因技术有限公司）；超敏发光液（批号：RJ239676）、
                                                [1]
        来流行病学研究显示，糖尿病是胰腺癌的危险因素之                            预染蛋白Marker（批号：26617）均购自美国Thermo Fish-
        一 [2-3] 。多项研究表明，二甲双胍作为治疗2型糖尿病的                     er Scientific公司；CCK-8 增殖检测试剂盒（日本 Dojindo
        一线治疗用药，可显著降低糖尿病患者发生胰腺癌的风                           公司，批号：CK04）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂
        险，并可显著延长胰腺癌患者的生存期，但并不能改善                           盒（杭 州 联 科 生 物 技 术 股 份 有 限 公 司 ，批 号 ：
        晚期或转移性胰腺癌患者的预后               [4-7] 。这提示二甲双胍        AP101-100-kit）；小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP-
        可能对胰腺癌的早期治疗具有重要的临床意义。                              DH）单克隆抗体（内参，批号：TA-08）、山羊抗小鼠 IgG
            目前学者普遍认为，上皮间质转化（Epithelial-mes-                二 抗（批 号 ：ZB-2305）、山 羊 抗 兔 IgG 二 抗（批 号 ：
        enchymal transition，EMT）是胰腺癌由早期发展至进展               ZB-2301）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔钙
        期的重要病理过程，其发生机制是目前研究的热点之                            黏着蛋白E（E-cadherin）多克隆抗体（美国Bioss公司，批
        一 。研究显示，有多条通路参与了胰腺癌的 EMT 过                         号：bs-1519R）；兔波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体（英国
          [8]
        程，目前研究最多的是转化生长因子β（TGF-β）通路，该
                                                           Abcam 公 司 ，批 号 ：ab92547）；兔 补 体 反 应 基 因 32
        通路可通过其下游 Smad 依赖性和 Smad 非依赖性两种                     （RGC-32）多克隆抗体（美国 OmnimAbs 公司，批号：
                                       [9]
        信号通路来诱导肿瘤细胞发生 EMT 。其中，Smad4 基
                                                           OM227971）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公
        因是 Smad 依赖性信号通路中的关键调节因子，也被认
                                                           司）；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，上海帝博思生物科技
                              [10]
        为是一种重要的抑癌因子 ；同时，相关研究指出，超过
                                                           有限公司）；其余试剂均为市售分析纯，水为双蒸水。
        半数的胰腺癌患者存在Smad4基因缺失或失活，且后者
                                                           1.3  细胞
        与患者预后不良密切相关            [11-12] 。鉴于此，本研究拟通过
                                                               人胰腺癌BxPC-3细胞由中国科学院上海生命科学
        检测不同剂量二甲双胍对 Smad4 基因天然缺失型胰腺
                                                           研究院细胞资源中心提供。
        癌 BxPC-3 细胞增殖、凋亡、迁移、EMT 等生物学行为的
                                                           2 方法
        影响，初步探讨该药对胰腺癌细胞上述恶性表型的影响
                                                           2.1  细胞培养
        及其基于 Smad 非依赖性通路的可能作用机制，以期为
                                                               将 BxPC-3 细胞接种至含 10％胎牛血清的 RPMI
        其抑制胰腺癌分子机制的阐释以及胰腺癌治疗新靶点
                                                           1640 完全培养液（以下简称“完全培养基”）中，置于
        的挖掘提供参考。
                                                           37 ℃、5％CO2培养箱（下同）中进行常规培养。
        1 材料
                                                           2.2  细胞增殖情况考察
        1.1  仪器
                                                               采用 CCK-8 法检测。取对数生长期 BxPC-3 细胞，
            HeaL Force HFI51 型 CO2 培养箱、HeaL Force Neo-
                                                           用 PBS 清洗 2 次，加入胰蛋白酶-EDTA 消化液消化 3
        fuge13R 型台式冷冻离心机（上海力康医疗设备有限公
                                                           min，加入 RPMI 1640 完全培养液（以下简称“普通培养
        司）；ChemiDoc XRS+型超高灵敏度化学发光成像系统、
                                                           基”）适量，混匀，吹打，以1 000 r/min离心5 min；弃去上
        T100 型聚合酶链反应（PCR）仪（美国 Bio-Rad 公司）；
                                                                                                   5
                                                           清液，加入普通培养基重悬，制成密度为1×10 个/mL的
        StepOne 型 荧 光 定 量 PCR 仪（ 美 国 ABI 公 司 ）；
                                                                                          4
        CKX31-A12PHP 型倒置相差显微镜（日本 Olympus 公                 单细胞悬液，按每孔100 μL（即1×10 个/孔）接种至96孔
        司）；NovoCyte 2060R 型流式细胞仪（美国 ACEA Bio 公             板中，培养；待细胞生长融合至60％时，将其随机分为对
        司）；RT-6100 型酶标仪（美国 Rayto 公司）；DYCP-31DN             照组和二甲双胍组（5、10、20 mmol/L，剂量设置参考文
        型电泳槽（北京六一仪器厂）；THZ-98型温控摇床（江苏                       献[13]），每组设 5 个复孔。弃去培养液，对照组加入普
        太仓创造电子有限公司）。                                       通培养基100 μL，各给药组加入含相应药物的普通培养
        1.2 药品与试剂                                          基 100 μL，继续培养 24 h；每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，
            盐 酸 二 甲 双 胍 对 照 品（批 号 ：D9351，纯 度 ：≥            避光培养2 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔
        98.0％，后文简称“二甲双胍”）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸                      的光密度（OD）值，并计算细胞存活率。细胞存活率＝
       （EDTA）消化液、胰蛋白酶（不含EDTA）、胎牛血清、结晶                      （试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100％。上述试
        紫染色液均购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI 1640                       验重复3次（下同）。
        完全培养液（南京凯基生物科技发展有限公司，批号：                           2.3 细胞凋亡情况考察
        KGM31800S-500）；Trizol 试 剂 、Ultrapure RNA 超 纯           采用流式细胞术检测。按“2.2”项下方法配制密度为
                                                                                                     4
                                                                4
        RNA提取试剂盒、HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒、                  1×10 个/mL的单细胞悬液，按每孔2 mL（即2×10 个/孔）
        UltraSYBR混合液、BCA蛋白定量试剂盒均购自北京康                      接种至6孔板中，培养；待细胞生长融合至60％时，将其

        中国药房    2020年第31卷第2期                                               China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 2  ·203  ·
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