Page 76 - 2020年1月第31卷第2期

3.0、4.0 mg/mL的药液（按各药材饮片的提取率换算，均 IL-6、TNF-α含量最高时，表示所对应的药材配比可达到
分别相当于原生药材质量浓度为1、1.5、3、4.5、6、7.5、9、 最佳药物效应 。
12、15、20 mg/mL）。 2.4 复方人参免疫增强方最佳配比提取物的免疫活性
2.2.3 4味药材生药量浓度范围筛选 采用CCK-8法测 考察
定各味药材提取物作用后 RAW264.7 细胞的增殖率，并 2.4.1 最佳配比提取物制备 按照“2.3”项下优选出的
根据细胞增殖率变化趋势筛选生药量浓度。取“2.2.1” 复方人参免疫增强方各组方药材的最佳配比（质量比
项下对数生长期细胞，按 5×10 个/孔接种于 96 孔板中， 1 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 4），称取人参 1.5 g、黄芪 3 g、黄精 3 g、枸杞 6 g
4
待细胞贴壁后，分为阴性对照组和提取物组，阴性对照 （人日服处方量）药材饮片混合后，按“2.1”项下方法制备
组加入完全培养基100 μL/孔，提取物组分别加入“2.2.2” 最佳配比复方提取物粉末（以下简称“复方提取物”），以
项下不同浓度的各味药材提取物药液100 μL/孔；另设不 水配制成相应浓度药液用于后续实验。
加细胞、仅加入完全培养基200 μL/孔的空白组，每组设 2.4.2 动物分组、造模及给药 取小鼠240只，随机分为
10个复孔。各组细胞于37 ℃、5％CO2培养箱中培养24 4 批，每批 60 只。每批小鼠均随机分为空白组（生理
h 后，弃去原培养基，每孔均先后加入无血清和双抗的 盐水）、模型组（生理盐水）、阳性药物组[左旋咪唑，4
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DMEM 高糖培养基 100μL 和 CCK-8 试剂 10 µL，按上述 mg/（kg·d），参照文献方法 设置剂量]和复方提取物低、
条件继续培养 1 h。培养完毕后，采用酶标仪在 450 nm 中、高剂量组[0.952 8、1.905 6、3.811 2 g/（kg·d），以提取
波长处检测各孔光密度（OD）值，根据公式计算细胞的 物质量计算，分别相当于人日服处方量的10、20、30倍]，
增殖率：细胞增殖率（％）＝（提取物组细胞OD值－空白 每组10只。各组小鼠分别灌胃生理盐水或相应药液，灌
组OD值）/（阴性对照组OD值－空白组OD值）×100％。 胃体积为10 mL/kg，qd，连续给药30 d。除空白组外，其
2.3 组方药材最佳配比优选 余组小鼠自开始给药起第24天时腹腔注射环磷酰胺40
[17]
2.3.1 均匀设计试验方案 采用均匀设计法 进行试 mg/（kg·d），qd，连续注射3 d，以建立免疫低下模型。给
验设计。以人参、黄芪、黄精、枸杞各饮片的生药量浓度 药结束后，各批小鼠分别进行后续指标检测或考察。
（分别表示为X1、X2、X3、X4，g/mL）为因素，并基于“2.2”项 2.4.3 小鼠脾脏和胸腺指数的测定 取“2.4.2”项下第1
下筛选获得的上述4味组方药材的生药量浓度范围选取 批小鼠，于末次灌胃给药后禁食15 h，称定体质量后，脱
4
7 个浓度梯度为不同水平，根据 U7 （7）表设计药材配比 颈处死；无菌条件下取其脾脏、胸腺，称定质量并计算脏
试验。均匀设计试验方案详见表1。 器系数（胸腺指数＝胸腺质量/体质量×100％；脾指数＝
表1 均匀设计试验方案 脾质量/体质量×100％）。
Tab 1 Uniform design test plan 2.4.4 小鼠脾淋巴细胞增殖能力考察 采用脾淋巴细
胞转化试验考察小鼠脾淋巴细胞的增殖能力。取
实验号 X1，g/mL X2，g/mL X3，g/mL X4，g/mL
配比1 1.5 4 5 5.5 “2.4.3”项下小鼠脾脏，置于装有适量 Hank’s 液的平皿
配比2 2 6 8 5 中，制成单个细胞悬液，滤过，以 1 000 r/min 离心 10
配比3 2.5 8 4 4.5 min，弃去上清液，调整细胞浓度为3×10 个/mL。每份脾
6
配比4 3 3 7 4
配比5 3.5 5 3 3.5 细胞悬液分两孔加入24孔板中，每孔1 mL，然后一孔加
配比6 4 7 6 3 入ConA试液75 μL，另一孔加入含100 U/mL青-链霉素
配比7 4.5 9 9 6 双抗、10％胎牛血清的 RPMI 1640 细胞培养液 75 μL 作
2.3.2 细胞因子试验优选组方药材生药量的最佳配比 为对照孔。细胞置于 37 ℃、5％CO2的培养箱中培养 72
取“2.2.1”项下对数生长期细胞，以完全培养基制成细 h。培养结束前 4 h，每孔吸弃上清 0.7 mL，另加入不含
胞悬液，按5×10 个/孔接种于 96 孔板中，每孔100 μL，置 血清和双抗的 RPMI 1640 培养基 0.7 mL 和 5 mg/mL 的
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于37 ℃、5％CO2的培养箱中培养。待细胞贴壁后，随机 MTT试液50 μL，继续培养至结束；然后每孔细胞加入酸
分为空白对照组、阳性对照组和均匀设计配比 1～7 性异丙醇1 mL，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。采用
组，空白对照组加入完全培养基，阳性对照组加入 10 酶标仪在570 nm 波长处测定各孔OD值，以光密度差值
μg/mL的LPS溶液（以完全培养基配制），均匀设计配比 表示脾淋巴细胞的增殖能力（光密度差值＝ConA 诱导
1～7组按表1方案（各水平均按生药量计）加入4种药材 孔 OD 值－对照孔 OD 值），光密度差值越大，则表示细
提取物混合物药液（以完全培养基配制），每孔 100 μL， 胞增殖能力越强。
按上述条件继续培养 24 h。每组设 10 个复孔平行试 2.4.5 小鼠血清溶血素含量测定 取“2.4.2”项下第2批
验。收集各组细胞上清液，采用相应试剂盒按说明书方 小鼠，在灌胃给药第 25 天时，腹腔注射 4％SRBC 悬液
法操作，检测 NO、IL-6、TNF-α含量。以人参、黄芪、黄 （以生理盐水配制）0.2 mL，qd，连续注射 3 d。于末次灌
精、枸杞的生药量浓度（X1、X2、X3、X4 ）为自变量，以 NO、 胃给药后 1 h 时，眼球取血，收集血清。血清以 SA 缓冲
IL-6、TNF-α含量为因变量（Y），进行多元逐步回归分析 液稀释 200 倍后，取 1 mL 置于试管内，依次加入 4％
并得出各指标的回归方程。当 Y 取最大值时，即 NO、 SRBC悬液0.5 mL、补体（取SRBC 1 mL、豚鼠血清5 mL

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