Page 77 - 2020年1月第31卷第2期

混匀，4 ℃冷藏后取上清液，以8倍体积SA缓冲液稀释， mg/mL）、黄精生药量浓度为3～9 mg/mL（相当于提取物
即得）1 mL；同时设置不加血清的空白对照管（以 SA 缓 0.45～1.35 mg/mL）、枸杞生药量浓度为3～6 mg/mL（相
冲液代替）。将试管置于37 ℃水浴中保温20 min，在冰 当于提取物 0.6～1.2 mg/mL）时，细胞增殖率呈上升趋
浴中终止反应，以 2 000 r/min 离心 10 min；取上清液 1 势，因此在上述浓度范围内进行后续均匀设计试验。不
mL，加都氏试剂3 mL，充分混匀，放置10 min，采用酶标 同生药浓度的组方药材对细胞活性的影响见图1。
仪于540 nm波长处测定吸收度。另取4％SRBC细胞悬 140
液0.25 mL，加入都氏试剂3.75 mL混匀，在540 nm波长 120 人参
处测定 SRBC 半数溶血时的吸收度 。以半数溶血值 ％ 100 黄芪
[19]
（HC50 ）表示血清溶血素含量，按公式计算：HC50＝（样品 细胞增殖率， 80 黄精
枸杞
60
管吸收度－空白对照管吸收度）/（SRBC 半数溶血时的 40
吸收度－空白对照管吸收度）×稀释倍数。 20
2.4.6 小鼠血清中 IL-2、IgM、IgG、IgA 含量测定 取 0
0 5 10 15 20 25
“2.4.2”项下第 3 批小鼠，于末次灌胃给药后 1 h 时，眼球 药材生药量浓度，mg/mL
取血，收集血清。采用相应 ELISA 试剂盒，按说明书要 图1 不同生药量浓度的组方药材对细胞活性的影响
求操作测定血清中IL-2、IgM、IgG、IgA的含量。 Fig 1 Effects of medicinal materials with different
2.4.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定 取“2.4.2”项 crude drug concentrations on cell activity
下第 4 批小鼠，于末次灌胃给药后 1 h 时腹腔注射 20％ 3.2 复方人参免疫增强方组方药材最佳配比
鸡红细胞悬液（生理盐水配制）1 mL，30 min 后脱颈处 细胞因子试验结果显示，与空白对照组比较，阳性
死，取其仰卧位固定于鼠板中，腹腔注射生理盐水2 mL， 对照组和均匀设计试验配比 1～7 组细胞中 NO、IL-6、
以适当速度转动鼠板 1 min。吸取小鼠腹腔洗液 1 mL， TNF-α的含量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），详见表2。
平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内， 表 2 各组细胞中 NO、IL-6、TNF-α的含量（x±±s，n＝
在37 ℃、5％CO2的培养箱中培养30 min后，在生理盐水 10）
中漂洗，晾干；加入丙酮-甲醇混合液（1 ∶ 1，V/V）固定，以 Tab 2 Contents of NO，IL-6 and TNF-α in cells of
4％Giemsa 的 PBS 溶液染色 3 min，再以水漂洗，晾干。 each group（x±±s，n＝10）
在油镜下对巨噬细胞（镜下紫红色为细胞核染色，蓝紫 组别 NO，μmol/mL IL-6，pg/mL TNF-α，pg/mL
色为细胞质染色）计数，并计算吞噬百分率和吞噬指 空白对照组 4.3±0.7 115.476±10.182 185.687±9.164
数[吞噬百分率（％）＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬 阳性对照组 9.2±1.1 ＊＊ 315.288±9.118 ＊＊ 412.405±10.135 ＊＊
均匀设计配比1组 9.8±0.9 ＊＊ 381.406±8.076 ＊＊ 523.518±11.355 ＊＊
细胞总数×100％；吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/ 均匀设计配比2组 5.6±0.7 ＊ 316.081±8.687 ＊＊ 501.849±8.978 ＊＊
巨噬细胞数]。 均匀设计配比3组 13.2±3.1 ＊＊ 347.209±11.216 ＊＊ 474.063±11.358 ＊＊
2.5 复方人参免疫增强方最佳配比提取物的急性毒性 均匀设计配比4组 9.4±0.8 ＊＊ 359.591±9.338 ＊＊ 442.950±9.683 ＊＊
均匀设计配比5组 11.7±0.7 ＊＊ 344.734±8.755 ＊＊ 404.578±11.624 ＊＊
考察
均匀设计配比6组 8.8±1.5 ＊＊ 312.999±8.320 ＊＊ 373.672±8.926 ＊＊
参照本课题组前期研究 并进行改良实验。取小 均匀设计配比7组 7.8±1.4 ＊＊ 295.841±11.202 ＊ 342.258±10.215 ＊
[20]
鼠20只，灌胃复方提取物药液（以水配制成0.40 g/mL的 注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
药液，以提取物计算），每次20 mL/kg，灌胃2次，给药间 Note：vs. blank control group， P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
隔6 h（相当于人推荐日摄入量的178倍）。连续观察14 对表 2 结果进行逐步回归分析，得出各指标回归方
d，观察并记录小鼠的一般状态、体质量变化、中毒特征 程，NO、IL-6、TNF-α含量水平越高，即 Y 取值越大时，该
以及死亡情况等，测定半数致死量（LD50 ）和最大耐受剂 方增强免疫力效果越好。回归分析结果见表3。
量（MTD）。 表3 均匀设计回归分析结果
2.6 统计学方法 Tab 3 Results of uniform design regression analysis
采用 SPSS 16.0 统计学软件对实验数据进行处理。 指标 回归方程 R P 药材生药量优选结果
NO Y＝15.288－0.971X3 0.500 ＜0.001 黄精3 g/mL
实验数据均以 x±s 表示，组间比较采用方差分析；采用
IL-6 Y＝623.902－62.116X1 0.971 ＜0.001 人参1.5 g/mL
逐步回归分析对均匀设计试验结果进行统计分析。P＜ TNF-α Y＝393.499－9.714X2－8.854X3+12.165X4 0.792 ＜0.002 黄芪3 g/mL，枸杞6 g/mL
0.05为差异有统计学意义。 由表 3 结果换算，复方人参免疫增强方的最佳配比
3 结果 为：人参、黄芪、黄精、枸杞生药质量比1∶2∶2∶4。
3.1 复方人参免疫增强方组方药材生药量浓度范围 3.3 复方人参免疫增强方最佳配比提取物的免疫活性
细胞活性试验结果显示，人参生药量浓度为 1.5～ 3.3.1 小鼠脏器指数 与空白组比较，模型组小鼠的脾
4.5 mg/mL（相当于提取物 0.18～0.54 mg/mL）、黄芪生 指数和胸腺指数均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型
药量浓度为 3～12 mg/mL（相当于提取物 0.42～1.68 组比较，阳性药物组和复方提取物低、中、高剂量组小鼠的

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