Page 82 - 2020年1月第31卷第2期

随机分为对照组和二甲双胍组（5、10、20 mmol/L），每组 表1 qRT-PCR引物序列
设 5 个复孔。弃去培养液，对照组加入普通培养基 2 Tab 1 qRT-PCR primer sequence
mL，各给药组加入含相应药物的普通培养基2 mL，继续 基因 引物序列 引物长度，bp 产物长度，bp
培养 24 h；弃去上清液，用 PBS 清洗 2 次，用不含 EDTA E-cadherin 上游：5′-CTCACATTTCCCAACTCCTCT-3′ 21 234
下游：5′-TGTCACCTTCAGCCATCCT-3′ 19
的胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清 Vimentin 上游：5′-TGGATTCACTCCCTCTGGTT-3′ 20 103
液，细胞用PBS清洗2次，以1 000 r/min离心5 min，收集 下游：5′-TGATGCTGAGAAGTTTCGTTG-3′ 21
RGC-32 上游：5′-GCGCTGTGCGAGTTTGA-3′ 17 220
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细胞（约 1.5×10 个）。用凋亡检测试剂盒中的 Binding
下游：5′-CTGGGGTAGAGTCTGTTGGAG-3′ 21
buffer 试剂 500 μL 重悬细胞，于暗室中依次加入 Annex- GAPDH 上游：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′ 20 224
in Ⅴ-FITC 染液 5 μL、PI 染液 5 μL，混匀，室温避光反应 下游：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′ 19
15 min，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。 离心 10 min，取上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度。蛋
2.4 细胞迁移能力考察 白于100 ℃变性后，取50 μg进行聚乙烯酰胺凝胶电泳，
采用Transwell迁移试验考察。按“2.2”项下方法配 电泳后湿法转移至 PVDF 膜上，以 5％胎牛血清于 4 ℃
制密度为2×10 个/mL的单细胞悬液，按每孔100 μL（即 封闭过夜；加入相应一抗（GAPDH、E-cadherin、Vimen-
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tin、RGC-32 的稀释度分别为 1 ∶ 2 000、1 ∶ 500、1 ∶ 2 000、
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2×10 个/孔）接种至 Transwell 小室（即“上室”）中，将其
1 ∶ 1 500），于室温摇床中孵育 3 h；用 TBST 缓冲液清
随机分为对照组和二甲双胍组（10、20 mmol/L，剂量参
洗 10 min×3 次，加入二抗（GAPDH 加入山羊抗小鼠
考“2.2”“2.3”项下结果设置），于各组下室24孔板中加入
IgG 二抗，其余蛋白加入山羊抗兔 IgG 二抗，稀释度均
含相应药物的普通培养基600 μL，每组设3个复孔，培养
为 1 ∶ 2 000），于室温摇床中孵育 2 h；用 TBST 缓冲液清
24 h。取出小室，以PBS清洗后，用棉签擦拭除去底部内
洗 10 min×3 次，以超敏发光液显色后，置于超高灵敏度
面未穿膜的细胞，用4％多聚甲醛溶液固定30 min后，以
化学发光成像系统中成像。采用Image J 1.8软件分析，
0.1％结晶紫染色液染色 15 min。用 PBS 冲洗 Transwell
以目标蛋白与内参GAPDH的灰度值比值来表示该蛋白
小室，并晾干、倒置。使用倒置相差显微镜观察，随机选
的相对表达量。
取8个高倍视野（×200），记录每个视野内的迁移细胞数
2.7 统计学方法
（染成紫色者），取其平均值作为迁移细胞数。
采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。采用
2.5 相关基因mRNA表达情况考察 Kolmogorov-Smirnov检验进行正态分布分析，符合正态
采用实时定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）检测。 分布的计量资料以x±s表示，采用t检验；不符合正态分
按“2.2”项下方法配制密度为 1×10 个/mL 的单细胞悬 布的计量资料以中位数±四分位数间距表示，采用Wil-
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液，按每孔2 mL（即2×10 个/孔）接种于6孔板中，培养， coxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
待细胞生长融合至60％时，将其随机分为对照组和二甲 3 结果
双胍组（10、20 mmol/L），每组设3个复孔。弃去培养液， 3.1 二甲双胍对BxPC-3细胞增殖的影响
对照组加入普通培养基2 mL，各给药组加入含相应药物 与对照组比较，10、20 mmol/L二甲双胍组细胞存活
的普通培养基 2 mL，继续培养 24 h。采用 Trizol 试剂提 率均显著降低，且显著低于 5 mmol/L 二甲双胍组（P＜
取细胞总 RNA，使用 HiFiScript cDNA 第一链合成试剂 0.05）；而 5 mmol/L 二甲双胍组细胞存活率与对照组比
盒将其逆转录为 cDNA，再以 GAPDH 为内参，分别对 较，10、20 mmol/L 二甲双胍组细胞存活率组间比较，差
E-cadherin、Vimentin、RGC-32 编码基因进行实时定量 异均无统计学意义（P＞0.05），详见表2。
PCR扩增。反应体系（共20 μL）：cDNA模板2 μL，Ultra- 表2 二甲双胍对BxPC-3细胞增殖和凋亡的影响（x±±s，
SYBR混合液10 μL，上、下游引物（序列见表1）各0.8 μL， n＝3）
双蒸水 6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性 60 s，95 ℃变性 Tab 2 Effects of metformin on the proliferation and
15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用 apoptosis of BxPC-3 cells（x±±s，n＝3）
2 －ΔΔCt 法以 Excel 2017 软件计算各目标 mRNA 的相对表 组别 细胞存活率，％ 细胞凋亡率，％
对照组 100 3.63±0.25
达量（Ct表示每个反应管内荧光信号强度达到设定阈值 5 mmol/L二甲双胍组 95.34±2.11 5.29±0.19
时所经历的循环数）。 10 mmol/L二甲双胍组 82.77±3.52 ＊# 8.90±0.29 ＊#
20 mmol/L二甲双胍组 78.52±3.38 ＊# 24.98±0.87 ＊#Δ
2.6 相关蛋白表达情况考察
注：与对照组比较，P＜0.05；与 5 mmol/L 二甲双胍组比较，P＜
#
＊
采用 Western blotting 法检测。按“2.5”项下方法进
Δ
0.05；与10 mmol/L二甲双胍组比较，P＜0.05
行细胞接种、分组、给药，每组设3个复孔。培养24 h后， Note：vs. control group， P＜0.05；vs. 5 mmol/L metformin group，
＊
采用RIPA细胞裂解液裂解细胞，于4 ℃下以12 000 r/min # P＜0.05；vs. 10 mmol/L metformin group，P＜0.05
Δ
·204 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 2 中国药房 2020年第31卷第2期