Page 70 - 2020年1月第31卷第2期
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有限公司设计、合成；氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂均                          （电压：110 V，时间：15 min），并置于凝胶成像分析系统
        为分析纯，水为超纯水。                                         上成像。采用 Image-pro Plus V 7.0 图像分析，以目的基
        1.3 动物                                              因和内参β-actin条带的光密度（OD）值比值来表示目的
            SPF 级健康昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）                     基因mRNA的表达水平。上述试验重复3次。
        g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证                                          表1 PCR引物序列
        号：SYXK（桂）2014-0003。实验室温度为（20±2）℃，所                             Tab 1 PCR primer sequence
        有小鼠均自由进食、饮水。                                        目标基因                引物序列                 产物大小，kb
                                                            Col-Ⅰ      上游：5′-TGCCGTGACCTCAAGATGTG-3′   462
        2 方法
                                                                       下游：5′-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3′
        2.1 分组、造模与给药                                        TIMP-1     上游：5′-GCCTCTGGCATCCTCTTG-3′     287
                                                                       下游：5′-CTGCGGTTCTGGGACTTG-3′
            将昆明种小鼠 60 只随机分为正常组、模型组、秋水
                                                            TIMP-2     上游：5′-CCAAAGCAGTGAGCGAGAA-3′    262
        仙碱组（阳性对照，0.2 mg/kg，剂量设置参照人等效剂量                                 下游：5′-TCCCAGGGCACAATAAAGTC-3′
        换算而得）以及葫芦茶苷低、中、高剂量组（3、6、12 mg/kg，                   β-actin    上游：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′  240
                                                                       下游：5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′
        剂量设置参照本课题组前期研究结果），每组10只。所
                                                            2.5 小鼠肝组织中MMP-2、TGF-β1蛋白表达水平检测
        有小鼠禁食过夜后，正常组小鼠腹腔注射等体积橄榄
                                                                采用 Western blotting 法检测。取小鼠肝组织适量，
        油，其余各组小鼠均腹腔注射 10％CCl4橄榄油溶液（5
                                                            加入RIPA裂解液（含1％蛋白酶抑制剂）1 mL，于4 ℃下
        mL/kg）以复制肝纤维化模型，每周2次，连续8周 。自
                                                  [10]
                                                            裂解后，并于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min。取上清
        第3周起，各给药组小鼠均灌胃相应药物，正常组和模型
                                                            液，采用 BCA 法测定蛋白含量，随后加入 SDS-PAGE 蛋
        组小鼠均灌胃等体积 2％CMC-Na 溶液，每日 1 次，连续
                                                            白上样缓冲液适量，于95 ℃水浴中变性5 min。取变性
        6周。
                                                            后的蛋白进行 SDS-PAGE 电泳分离（电压：80 V，时间：
        2.2  小鼠血清学指标检测
                                                            30 min），电泳完成后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜
            末次给药 10 h 后，所有小鼠均摘取眼球取血，分离
                                                            上，用5％脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应一抗（稀释度
        血清，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）以自动酶标仪
                                                            均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用 TBST 溶液清洗 5
        检测其血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量。严格按照相
                                                            min×3 次，加入二抗（MMP-2 和 TGF-β 1 加入山羊抗兔
        应试剂盒说明书操作。
                                                            IgG 二抗，β-actin 加入山羊抗小鼠 IgG 二抗，稀释度均
        2.3  小鼠肝组织中Hyp、SOD、MDA、GSH-Px含量检测
                                                            为 1 ∶ 1 000），室温孵育1 h后，用三羟甲基氨基甲烷盐酸
            小鼠取血后立即脱颈处死，剖取肝脏，于肝脏右叶
                                                            盐（TBST）溶液清洗 5 min×3 次，以 ECL 显色后，置于全
        相同部位取肝组织约 0.1 g，置于含生理盐水的匀浆器
                                                            自动化学发光图像分析系统上成像。使用 QuantityOne
        中，于冰浴中制备成10％肝匀浆。采用考马斯亮蓝法对                           4.6软件分析，以目标蛋白与内参β-actin条带的灰度值比
        肝组织蛋白进行定量后，采用分光光度法以可见光分光                            值来表示目标蛋白的表达水平。上述试验重复3次。
        光度计检测其肝组织中 Hyp、SOD、MDA、GSH-Px 的含                    2.6  统计学方法
        量。严格按照相应试剂盒说明书操作。                                       采用SPSS 19.0软件对数据进行统计处理。计量资
        2.4  小鼠肝组织中ⅠⅠ型胶原（Col-ⅠⅠ）、金属蛋白酶组织                    料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比
        抑制因子1（TIMP-1）、TIMP-2 mRNA表达水平检测                     较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
            取小鼠肝组织适量，采用 Trizol 法提取肝组织总                      3 结果
        RNA。取上述总 RNA 2 µg，按 First Strand cDNA Syn-          3.1  葫芦茶苷对小鼠血清中 ALT、AST、HA、IL-6 含量
        thesis Kit 说明书方法，在 M-MLV 逆转录酶作用下逆转                  的影响
        录合成cDNA。以上述cDNA为模板，采用逆转录-聚合                             与正常组比较，模型组小鼠血清中 ALT、AST、HA、
        酶链反应法（RT-PCR）以PCR扩增仪进行扩增。反应体                        IL-6 的含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给
        系（20 µL）：cDNA 模板 2 µL，10 µmol/L 的上、下游引物             药组小鼠血清中上述指标的含量均显著降低（P＜0.05
        （序列见表1）各l µL，2×PCR Taq Mix 10 µL，用无酶水补              或P＜0.01），详见表2。
        至20 µL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，                3.2  葫芦茶苷对肝组织中 Hyp、SOD、MDA、GSH-Px
        适宜温度（Col-Ⅰ：55 ℃；TIMP-1和TIMP-2：52 ℃）退火               含量的影响
        30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 个循环；72 ℃再延伸 10 min。               与正常组比较，模型组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px
        反应结束后，取扩增产物 2.0 µL，进行琼脂糖凝胶电泳                        含量均显著降低，而 Hyp、MDA 含量均显著升高（P＜


        ·192  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 2                                   中国药房    2020年第31卷第2期
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