Page 84 - 2019年10月第30卷第20期

12 000×g 冷冻离心 10 min，取上清液，采用 BCA 试剂盒 组织中 P-gp、Mrp2、Bcrp 蛋白表达水平显著升高，差异
进行蛋白浓度测定。取蛋白样品适量，煮沸变性，在 均有统计学意义（P＜0.01）。各组大鼠十二指肠组织中
200 V 恒压下经 10％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 3种外排转运蛋白电泳图见图1，蛋白表达水平检测结果
（SDS-PAGE）电泳分离，再以 300 mA 恒流电转印至 见表2。
PVDF 膜，用 5％脱脂奶粉于室温封闭 2 h；然后分别
加入 P-gp 抗 体（1 ∶ 1 000）、Mrp2 抗 体（1 ∶ 20）、Bcrp Mrp2 190 kDa
抗体（1 ∶ 100）、Claudin-1 抗体（1 ∶ 500）、Occludin 抗体
（1∶1 000）、ZO-1 抗体（1 ∶ 500）、GAPDH抗体（1 ∶ 1 000），
4 ℃下孵育过夜；次日以TBST缓冲液洗涤10 min×3次， P-gp 170 kDa
然后加入 HRP 标记的二抗（1 ∶ 3 000），室温孵育 1 h 后，
以TBST 洗涤10 min×3次；以ECL超敏化学发光液反应
后，采用凝胶成像仪检测。采用 Image J 1.8.0 软件对蛋 Bcrp 70 kDa
白条带进行图像分析，以GAPDH为内参，计算各目标蛋
白的相对灰度值，用以表示蛋白表达水平。
2.5 大鼠十二指肠组织中外排转运蛋白和紧密连接蛋
GAPDH 36 kDa
白相应基因的mRNA表达水平检测
采用实时定量 PCR 法检测目标基因 mRNA。取 正常组 附子水提物 附子水提物 附子水提物
低剂量组
高剂量组
中剂量组
“2.3”项下采集的大鼠十二指肠肠段组织，剪碎，以 图1 各组大鼠十二指肠组织中P-gp、Mrp2、Bcrp蛋白
Trizol LS 试剂盒提取总 RNA，采用酶标仪在 260、280 电泳图
nm 波长处检测吸光度并计算两者比值（1.8～2.0 即可） Fig 1 Electrophoresis of P-gp，Mrp2 and Bcrp pro-
以考察RNA纯度。取总RNA适量，在1×TAE缓冲液中 teins in duodenum of rats in each group
进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，然后在紫外
表2 各组大鼠十二指肠组织中外排转运蛋白和紧密连
光下观察（可见清晰无拖带的 28 S、18 S、5 S 等条带即
接蛋白表达水平（x±±s，n＝8）
可）。取总 RNA 5 μg，采用反转录试剂盒制备 cDNA 并
Tab 2 Protein expression levels of efflux transporters
适当稀释后，进行 PCR 反应。总反应体系（共 10 μL）：
cDNA 2 μL、2×SYBR 5 μL、上游引物 1 μL、下游引物 and tight junction proteins in duodenum of
rats in each group（x±±s，n＝8）
1 μL、超纯水 1 μL。反应条件：95 ℃热激变性 10 min，
95 ℃复性 5 s，60 ℃延伸10 s，72 ℃延伸15 s，共45个循 组别 P-gp Mrp2 Bcrp Claudin- 1 Occludin ZO-1
正常组 0.273±0.001 0.258±0.002 0.110±0.001 0.125±0.005 0.033±0.005 0.351±0.033
环。以 GAPDH为内参，采用2 －ΔΔCt 法 计算P-gp、Mrp2、
[19]
附子水提物低剂量组 0.305±0.009 ## 0.796±0.022 ## 0.236±0.007 ## 0.361±0.018 ## 0.152±0.006 0.573±0.011 ##
##
Bcrp、Claudin-1、Occludin、ZO-1的mRNA表达水平。引 附子水提物中剂量组 0.385±0.019 ## 0.798±0.077 ## 0.193±0.009 ## 0.659±0.071 ## 0.143±0.036 0.581±0.010 ##
##
##
物序列见表1。 附子水提物高剂量组 0.346±0.019 ## 0.688±0.035 ## 0.343±0.026 ## 1.019±0.109 ## 0.198±0.003 0.601±0.022 ##
表1 引物序列 注：与正常组比较，P＜0.01
##
##
Tab 1 Primer sequence Note：vs. normal group， P＜0.01
基因名称 引物序列（5′-3′） 基因名称 引物序列（5′-3′） 3.2 附子水提物对大鼠十二指肠中 3 种紧密连接蛋白
GAPDH 正向：TGGGTTTCCCGTTGATGA Claudin-1 正向：CTCACAGAGAGGGGTCGTTG 表达的影响
反向：AGGGCTGCCTTCTCTTGT 反向：ACTGTTAGCGGCAGTTTGGT 与正常组比较，附子水提物各剂量组大鼠十二指肠
P-gp 正向：GCAGGTTGGCTGGACAGATT Occludin 正向：GGGGTGATTCGGATCCTGTC
反向：GGAGCGCAATTCCATGGATA 反向：TCCTCCAAAGATGCCCGTTC 组织中 Claudin-1、Occludin、ZO-1 蛋白表达水平均显著
Mfp2 正向：TGATCGGTTTCGTGAAGAGCT ZO-1 正向：CCCTTACCTTTCGCCTGAAAC 升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。各组大鼠十二
反向：ACGCACATTCCCAACACAAA 反向：CCTTCGTCTCTGAGCATCGT 指肠组织中 3 种紧密连接蛋白电泳图见图 2，蛋白表达
Bcrp 正向：GTTTGGACTCAAGCACAGCA
反向：TGAGTTTCCCAGAAGCCAGT 水平检测结果见表2。
2.6 统计学方法 3.3 附子水提物对大鼠十二指肠组织中外排转运蛋白
所有试验至少独立重复3次。采用 GraphPad 7.0软 对应基因mRNA表达的影响
件对试验数据进行统计学分析。计量资料均以 x±s 表 与正常组比较，附子水提物各剂量组大鼠十二指肠
示，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学 组织中 P-gp 的 mRNA 表达水平，附子水提物低、高剂量
意义。 组 Bcrp 的 mRNA 表达水平均显著升高，差异均有统计
3 结果 学意义（P＜0.05）；其余基因的 mRNA 表达水平差异均
3.1 附子水提物对大鼠十二指肠组织中外排转运蛋白 无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠十二指肠组织中外
表达的影响 排转运蛋白对应基因的 mRNA 表达水平检测结果见
与正常组比较，附子水提物各剂量组大鼠十二指肠 表3。

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