Page 83 - 2019年10月第30卷第20期
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附子为毛茛科乌头属植物乌头（Aconitum carmi-                   司，批号：ET1701-76）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山
        chaeli Debx.）的子根及其加工品，有补火助阳、散寒止痛                    羊抗兔多克隆IgG（H+L）（二抗，上海碧云天生物技术有
        之功效，具有扩张血管、抗炎、抗肿瘤等药理作用 ，在临                          限公司，批号：A0208）；Trizol LS试剂（美国Invitrogen公
                                                  [1]
        床上广泛用于治疗心血管和消化系统疾病                    [2-3] 。在临床    司，批号：10296010）；逆转录试剂盒（北京全式金生物技
        应用时，附子常与其他中药和/或化学药联用                   [3-5] ，因此增   术有限公司，批号：AT341-02）；SYBR Green 试剂（北京
        加了药物相互作用的机会。药物相互作用会影响药物                             聚合美生物科技有限公司）；PVDF 膜（0.22 μm，美国
        的吸收，导致药物血药浓度发生变化，进而对药物的疗                            Millipore 公司）；BCA 蛋白浓度试剂盒（批号：PC0020-
        效及毒性产生一定影响           [6-7] ，因此从吸收环节研究药物的            500）、彩虹 180 广谱蛋白 Marker（11～180 kDa，批号：
        相互作用具有重要意义。                                         PR1910）、总 RNA 提 取 试 剂 盒（批 号 ：R1200-50T）、
            近年来，越来越多的研究表明，外排转运蛋白和紧                          RT-PCR 试剂盒（批号：RP1100）、RIPA 裂解液、ECL Plus
        密连接蛋白在药物吸收方面有着重要的地位 。以P-糖                           超敏发光液等均购自北京索莱宝生物技术有限公司；上
                                               [8]
        蛋白（P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（Bcrp）和多药耐药蛋白 2                     样缓冲液、电泳液、转膜液等均购自美国 Thermo Fisher
        （Mrp2）为代表的外排转运蛋白广泛分布于小肠、肝脏、                         Scientific公司；水为色谱级。
        肾脏及血脑屏障中，其能抑制相应底物的吸收，在药物                            1.3 药材
        相互作用中起重要作用           [9-11] 。紧密连接是溶质通过旁细                附子黑顺片（批号：20150601）购自江西江中中药饮
                            [12]
        胞途径扩散的主要屏障 ，主要由跨膜蛋白[如密封蛋白                           片有限公司，经江西中医药大学药学院张寿文教授鉴定
        （Claudin-1）、闭合蛋白（Occludin）]和细胞质蛋白[如闭                为毛茛科乌头属植物乌头（A. carmichaelii Debx.）的子
                                [13]
        锁小带蛋白（ZO-1）]等组成 。紧密连接蛋白表达的变                         根加工饮片。
        化会导致细胞通透性的改变，而通透性的改变又会影响                            1.4  动物
        相应药物的吸收 。已有研究报道，附子活性成分对上                                SPF 级 SD 大鼠 32 只，雄性，体质量为（200±20）g，
                       [14]
                                     [15]
        述 3 种外排转运蛋白表达有影响 ，但由于临床上附子                          饲养于江西中医药大学实验动物科技中心屏障系统，动
        通常以水提取物形式使用，而附子提取物对上述转运蛋                            物使用许可证号：SYXK（赣）2017-0004。动物在环境温
        白的影响鲜见报道；同时，尚未见相关研究报道附子或                            度、湿度适宜的条件下进行实验，期间自由饮食。
        其提取物对上述 3 种紧密连接蛋白表达的影响。基于                           2 方法
        此，本课题组以大鼠为研究对象，考察附子水提物对其                            2.1  附子水提物浸膏的制备
        十二指肠组织中上述3种外排转运蛋白和3种紧密连接                                取黑顺片400 g，先后加入10、8倍量水（mL/g），分别
        蛋白及其对应基因表达的影响，以探讨附子水提物能否                            加热回流提取1 h，过滤；合并滤液，在40 ℃条件下高压
        通过调控外排转运和旁细胞吸收途径等机制影响药物吸                            水浴旋蒸浓缩，冷冻干燥，制得附子水提物冻干粉浸膏
        收，为附子与其他药物在临床的合理联用提供理论基础。                          （得率为 3.4％），保存备用。采用高效液相色谱法 检
                                                                                                        [16]
        1 材料                                                测，所得浸膏中双酯型生物碱含量（以次乌头碱、新乌头
        1.1  仪器                                             碱、乌头碱含量合计）为0.4％，单酯型生物碱含量（以苯
            BS124S 型电子分析天平（德国 Sartorius 公司）；                甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱
        R3002型旋转蒸发器（郑州瑞涵仪器有限公司）；1260型                       含量合计）为4.56％。
        高效液相色谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；3-18K                        2.2  分组及给药
        型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；HHS型电热恒温                            取大鼠32只，随机分为正常组和附子水提物低、中、
        水浴锅（上海博讯实业有限公司）；QYC-Z00型恒温摇床                        高剂量组[0.45、0.9、1.8 g/（kg·d），以生药量计算；参照
        （上海福玛实验设备有限公司）；ELX800型酶标仪（美国                        2015年版《中国药典》（一部）中附子的服用剂量 ，按等
                                                                                                     [17]
        BioTek公司）；ChemiDoc 凝胶成像仪（美国 Bio-Rad公                效剂量折算方法 计算并制定大鼠给药剂量]，每组 8
                                                                           [18]
                             TM
        司）；Bis-Tris Mini Gels 型电泳槽、Mini Gel Tank 型转印        只。除正常组大鼠灌胃相应体积的水外，附子水提物各
        槽（美国 NuPAGE 公司）；LightCycler 96 型实时定量聚               剂量组大鼠均灌胃相应附子水提物浸膏药液（以水为溶
                                        ®
        合酶链式反应（PCR）仪（美国Roche公司）。                            剂配制），给药体积均为0.1 mL/kg，连续给药7 d。
        1.2 药品与试剂                                           2.3 生物样本采集
            兔源多克隆P-gp抗体、鼠源单克隆Mrp2抗体（美国                          给药结束后，断颈处死大鼠，在距其胃幽门部 1 cm
        Abcam公司，批号分别为ab170904、ab15603）；兔源多克                 处量取十二指肠肠段 10 cm，以液氮速冻后，立即于
        隆 Bcrp 抗体、兔源单克隆 GAPDH 抗体（武汉博士德生                     －80 ℃条件下保存，备测。
        物技术有限公司，批号分别为BA3746-2、M00227-5）；兔                   2.4  大鼠十二指肠组织中外排转运蛋白和紧密连接蛋
        源多克隆 Claudin-1 抗体、兔源多克隆 ZO-1 抗体（美国                  白的表达水平检测
        Omnimabs 公司，批号分别为 OM247267、OM296184）；                   采用 Western blotting 法检测目标蛋白。取“2.3”项
        兔源多克隆 Occludin 抗体（杭州华安生物技术有限公                       下采集的十二指肠肠段组织，以 RIPA 裂解液裂解后，


        ·2814  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 20                                中国药房    2019年第30卷第20期
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