Page 54 - 2019年10月第30卷第20期
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表1 引物序列
                     Tab 1 Primer sequence
        基因                  引物序列（5′-3′）          引物大小，bp
        Bcl-2          正义链TCCCATCAATCTTCAGCACTCT   105
                       反义链TCGATCTGGAAATCCTCCTAAT
        Bax            正义链GATGCGTCCACCAAGAAGCT     170              A. 对照组               B. BAC 10 μmol/L组
                       反义链CGGCCCCAGTTGAAGTTG
        Caspase-3      正义链CTCCACAGCACCTGGTTATT     100
                       反义链AAGCTTGTCGGCATACTGTT
        Beclin1        正义链CCGCAAGATAGTGGCAGAA      264
                       反义链CGACCCAGCCTGAAGTTAT
        P62            正义链GGGGACTTGGTTGCCTTTT      139
                       反义链CAGCCATCGCAGATCACATT
        LC3            正义链AATCCCGGTGATCATCGAGC     119          C. BAC 50 μmol/L组        D. BAC 100 μmol/L组
                       反义链GCCGGATGATCTTGACCAAC
        β-actin        正义链AGCACTGTGTTGGCGTACAG     194
                       反义链TCCCTGGAGAAGAGCTACGA
        平。取对数生长期细胞，按“2.5”项下方法分组和给药，
        提取总蛋白，采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白
                                                                E. BAC 200 μmol/L组       F. BAC 400 μmol/L组
        定量。取适量总蛋白，以 PBS 稀释至相同浓度后，加入                                 图2 各组细胞形态显微图（×100）
        5×Loading buffer 上样缓冲液，在 90 ℃金属浴条件下变
                                                           Fig 2 Morphological micrographs of cells in each
        性 10 min，于－20 ℃保存，待用。分别取上述变性蛋白
                                                                  group（×100）
        样 品 50 μ g，以 β-actin 为 内 参 ，在 80 V 条 件 下 进 行
        SDS-PAGE 凝胶电泳 90 min，以 200 mA 湿法转膜 80              抑制率差异无统计学意义；BAC 100、200、400 μmol/L剂
        min，放入含 5％脱脂奶粉的 PBST 缓冲液中室温封闭                      量组细胞增殖抑制率均显著升高，差异均有统计学意义
        1 h；然后分别加入β-actin、Bcl-2、Bax、Active Caspase-3、      （P＜0.05 或 P＜0.01），且剂量越高，其对细胞增殖的抑
        Beclin1、P62、LC3的相应一抗（稀释度均为1 ∶ 1 000），于             制率越高，结果见表2。这表明BAC对细胞的增殖抑制
        4 ℃孵育过夜；次日于常温脱色摇床上继续孵育 1 h 复                       作用呈剂量依赖趋势。
        温，PBST 缓冲液洗膜 10 min×3 次；然后根据一抗的种                   表 2   不同剂量 BAC 作用下 A549 细胞的增殖抑制率
        属，兔源的 Bcl-2、Bax、Active Caspase-3、Beclin1、P62、           （x±±s，n＝3）
        LC3 加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗、鼠源的β-actin 加              Tab 2  Proliferation inhibition rate of A549 cells trea-
        入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗（稀释度均为1 ∶ 10 000），                         ted with different doses of BAC（x±±s，n＝3）
        然后于室温下脱色摇床孵育 1 h；PBST 洗膜 10 min×3                  组别               剂量，μmol/L           细胞增殖抑制率，％
        次，在凝胶成像仪中采用 ECL 化学发光液显色。采用                         对照组                 0                    0
                                                           BAC给药组              10                 2.72±2.90
        Image J 1.52a 软件对蛋白条带进行图像分析，以β-actin
                                                                               50                 4.88±2.77
        为内参计算相对灰度值，用来表示蛋白表达水平。每组                                              100                 9.86±2.13 ＊
        设置3个复孔，试验均重复3次。                                                       200                21.68±4.49 ＊
        2.7  统计学方法                                                            400                43.65±5.30 ＊＊
                                                                           ＊
                                                                                  ＊＊
            采用SPSS 13.0统计软件对试验数据进行处理。计                         注：与对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
                                                                                      ＊＊
                                                                               ＊
        量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜                             Note：vs. control group， P＜0.05， P＜0.01
        0.05为差异有统计学意义。                                         与对照组比较，BAC 低、高剂量组细胞增殖抑制率
        3 结果                                               均 显 著 升 高 ，差 异 均 有 统 计 学 意 义（P＜0.05 或 P＜
                                                           0.01），且作用时间越长，其对细胞增殖的抑制率越高，结
        3.1 BAC对A549细胞形态的影响
            镜下可见，对照组细胞呈三角形、梭形或不规则形                         果见表 3。这表明 BAC 对细胞的增殖抑制作用呈时间
        等，很少见到漂浮的细胞，细胞质较为丰富，细胞核清晰                          依赖趋势。
        可见；随着BAC浓度增大，BAC各剂量组细胞开始出现                         3.3 BAC对A549细胞凋亡的影响
        皱缩现象，以 BAC 200、400 μmol/L 组尤为明显，细胞排                    与对照组比较，BAC 低、高剂量组细胞凋亡率均分
        列稀疏、细胞间连接较松散，并出现漂浮细胞，贴壁细胞                          别在药物作用 24、48 h 时有不同程度的上升，且随着
        基本无完整的细胞核及细胞质，多数细胞已开始溶解，                           BAC剂量增加和作用时间的延长，细胞凋亡率呈上升趋
        详见图2。                                              势，提示该促凋亡作用具有剂量、时间依赖趋势；其中，
        3.2  BAC对A549细胞增殖的影响                               BAC低剂量组细胞的早期、晚期凋亡率（作用48 h时）以
            与对照组比较，BAC 10、50 μmol/L剂量组细胞增殖                 及BAC高剂量组细胞的早期、晚期凋亡率（作用24、48 h


        中国药房    2019年第30卷第20期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 20  ·2785  ·
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