Page 53 - 2019年10月第30卷第20期
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（PCR）仪（美国ABI公司）。                                    于37 ℃、5％CO2的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁成形
        1.2 药品与试剂                                           后弃去原培养基，加入含 BAC 分别为 0（对照组）、10、
            BAC对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：                        50、100、200、400 μmol/L（给药剂量按预试验结果制定）
        MUST-17102610，纯度：98.9％）；RPMI-1640培养基、青-             的无血清基础培养基 100 μL，继续培养 24 h；弃去原培
        链霉素（美国 Hyclone 公司）；胎牛血清、胰酶、二甲基亚                     养基，加入含 10％CCK-8 试剂的无血清培养基 100 μL，
        砜（DMSO）（美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁                    继续培养2 h后采用酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸
        化学研究所）；Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3、P62、         光度（OD）。按公式计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率
        β-肌动蛋白（β-actin）引物（生工生物工程上海股份有限                     （％）＝（对照组细胞 OD 值－给药组细胞 OD 值）/（对照
        公司）；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒（南京凯基生物科                  组细胞OD值－空白组OD值）×100％。同时，按同样的
        技有限公司）；Trizol 试剂（北京索莱宝科技有限公司）；                      操作方法，设置对照组（不含BAC）和BAC低、高剂量组
        Transcription Kit Quanti Nova 逆转录试剂盒（德国 Qia-       （200、400 μmol/L；根据上述不同剂量组的增殖抑制率结
        gen 公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（美国 Thermo                     果，并考虑药物效果及细胞毒性制定，下同），同法培养
        Fisher Scientific公司）；RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生               24、48、72 h 后，分别检测各孔 OD 值并计算细胞增殖抑
        物科技有限公司）；兔抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗人Ac-                       制率。每组设置3个复孔，试验均重复3次。
        tive Caspase-3 单克隆抗体、兔抗人 LC3 单克隆抗体（杭                2.4 BAC对A549细胞凋亡的影响考察
        州华安生物科技有限公司）；兔抗人Bax单克隆抗体、兔                              采用流式细胞术检测细胞凋亡率。取对数生长期
        抗人 Beclin1 单克隆抗体、兔抗人 P62 单克隆抗体（美国                   细胞，胰酶消化，以 800 r/min 离心 5 min 后，用完全培养
        Cell Signaling Technology公司）；鼠抗人β-actin单克隆抗         基调整细胞密度至1×10 个/mL，接种2 mL于6孔板，于
                                                                                 5
        体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG二抗、HRP                       37 ℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞融合
        标记的羊抗鼠IgG二抗（成都ZenBioScience公司）；ECL                  率约为60％时弃去原培养液。将细胞分为对照组（不含
        化学发光液（合肥市Biosharp生物公司）；磷酸盐缓冲液                       BAC）和 BAC 低、高剂量组（200、400 μmol/L；剂量根据
        （PBS，pH 7.2）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-                    “2.3”项下考察结果制定，下同），加入含相应浓度 BAC
        PAGE）凝胶、电泳液、转膜液、PBST缓冲液、封闭液等试                       的无血清基础培养基2 mL，继续分别培养24、48 h后，加
        剂均为自行配制；水为超纯水。                                      入 0.25％不含 EDTA 的胰酶消化。收集各组细胞，4 ℃
        1.3  细胞                                             下以 800 r/min 离心 5 min；弃去上清，以 PBS 漂洗 2 次
            人肺癌A549细胞由川北医学院附属医院风湿免疫                         后，再以 PBS 500 μL 重悬细胞并计数。每组取 1×10 个
                                                                                                         6
        研究所贾艾敏研究员馈赠，购自美国模式菌种收集中心                            细胞，先后加入 AnnexinV-FITC、PI 染色试剂各 5 μL，混
        （ATCC）。                                             匀，在冰上避光孵育15 min后，在1 h内采用流式细胞仪
        2 方法                                                检测细胞凋亡情况。采用 FlowJo V10 软件进行数据采
        2.1  细胞培养                                           集及处理。每组设置3个复孔，试验均重复3次。
            将 A549 细胞接种于含 10％胎牛血清、1％青-链霉                    2.5  BAC 对 A549 细胞中相关凋亡基因和自噬基因表
        素的 RPMI-1640 培养基（即完全培养基，下同），置于                      达的影响考察
        37 ℃、5％CO2的培养箱中培养。待细胞长至融合时，以                            采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-
        胰酶消化后进行预培养，待细胞生长至对数期时，进行                            qPCR）法检测各目标基因表达水平。取对数生长期细
        后续试验。                                               胞，按“2.4”项下方法分为对照组和 BAC 低、高剂量组
        2.2  BAC对A549细胞形态的影响考察                             （200、400 μmol/L），加入含相应浓度BAC的无血清基础
            取对数生长期细胞，加入含 BAC 分别为 0（即不加                      培养基 2 mL，同法培养48 h。采用Trizol试剂提取各组
        药物，对照组）、10、50、100、200、400 μmol/L（均以终浓度              细胞总 RNA，并以紫外分光光度法检测 RNA 的浓度及
        计，给药剂量按预试验结果制定，下同）的无血清基础培                           纯度。然后以逆转录试剂盒进行逆转录获得 cDNA，采
        养基 100 μL。各组细胞于 37 ℃、5％CO2的培养箱中培                    用PCR仪检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、P62、LC3基
        养 24 h 后，在显微镜下观察细胞形态是否出现皱缩、变                        因的表达水平。按相应试剂盒说明书操作（反应体系共
        小、排列疏松等情况，以判断BAC是否对细胞产生促凋                           20 μL），扩增程序为：95 ℃预变性 2 min；95 ℃反应 5 s，
        亡作用。每组设置3个复孔，试验均重复3次。                               60 ℃退火及延伸 14 s，40 个循环。以β-actin 为内参，采
                                                                     [12]
        2.3 BAC对A549细胞增殖的影响考察                               用2  －ΔΔCt 法 计算各目标基因mRNA的表达水平。每组
            采用 CCK-8 法检测细胞增殖率。取对数生长期细                       设置3个复孔，试验均重复3次。引物序列见表1。
        胞，胰酶消化，以 800 r/min 离心 5 min 后，用完全培养基                2.6 BAC 对 A549 细胞中相关凋亡蛋白和自噬蛋白表
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        调整密度至5×10 个/mL，接种100 μL于96孔板；另设空                    达的影响考察
        白组，加入等体积完全培养基（不加入细胞）。各组细胞                               采用 Western blotting 法检测各目标蛋白表达水


        ·2784  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 20                                中国药房    2019年第30卷第20期
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