Page 44 - 2019年9月第30卷第18期
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2.4 细胞凋亡情况检测                                       2×TBⅡ Premix Ex Taq Ⅱ 10 µL、50×ROX Reference
                                                                   ®
            采 用 AO/EB 双 染 色 法 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的          Dye 0.4 µL、无酶水 6 µL。反应条件：95 ℃预变性 30 s；
        NG108-15 细胞适量，以 4×10 个/孔接种于 6 孔板中，培                95 ℃变性5 s，60 ℃延伸31 s，共40个循环。以GAPDH
                                 5
        养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设3个复孔。正常                      为内参，采用 2     －ΔΔ Ct 法计算各目的 mRNA 的相对表达量
        对照组加入完全培养基5 mL，各含药组加入含相应药物                         （Ct表示每个反应管内荧光信号强度达到设定阈值时所
        的完全培养基 5 mL，继续培养 24 h。除正常对照组外，                     经历的循环数）。上述试验重复3次。
        其余各组均按“2.2”项下方法复制 AD 细胞模型。随后                                        表1    引物序列
        用 PBS 清洗 2 次，每孔加入 AO/EB 染色试剂 20 μL 和                             Tab 1 Primer sequence
        PBS 1 mL，混匀，避光孵育2～5 min后，使用荧光倒置显                   基因                  序列                   产物长度，bp
        微镜观察细胞凋亡情况，并拍照[活细胞（VE）：核染色质                        GAPDH      上游：5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′   150
                                                                      下游：5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′
        着绿色，且结构正常；早期凋亡细胞（VA）：核染色质着
                                                           CDK5       上游：5′-GGCAATGATGTGGATGACCAG-3′  142
        绿色，呈固缩或圆珠状]。                                                  下游：5′-CGACGTTCACCAAGGATGTTGTAG-3′
        2.5 CDK5、GSK3β、Tau、p-Tau蛋白表达情况检测                   GSK3β      上游：5′-TTCTCGGTACTACAGGGCACCAG-3′  107
            采用 Western blotting 法检测。取对数生长期的                           下游：5′-GTCCTAGCAACAATTCAGCCAACA-3′
                                 5
        NG108-15 细胞适量，以 6×10 个/孔接种于 6 孔板中，培                2.7 CDK5、GSK3β、Tau蛋白分布情况检测
        养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设5个复孔。正常                          采用免疫荧光法检测。取对数生长期的NG108-15
                                                                           5
        对照组加入完全培养基1 mL，各含药组加入含相应药物                         细胞适量，以4×10 个/孔接种于6孔板中（培养板中有玻
        的完全培养基 1 mL，继续培养 24 h。除正常对照组外，                     片），培养 24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设 3 个复
        其余各组均按“2.2”项下方法复制 AD 细胞模型。随后                       孔。正常对照组加入完全培养基1 mL，各含药组加入含
        吸弃上清液，用PBS清洗2次，加入蛋白裂解液（RIPA高                       相应药物的完全培养基1 mL，继续培养24 h。除正常对
        效快速裂解液、PMSF、磷酸酶抑制剂按体积比100 ∶ 1 ∶ 1                  照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制 AD 细胞模
        配制）150 μL，于冰上裂解30 min，收集上清液，于4 ℃下                  型。随后吸弃各孔上清液，用 PBS 清洗 5 min×3 次。将
        以12 000 r/min离心15 min，取上清液，使用微量核酸蛋                 细胞置于 4％多聚甲醛溶液中固定 20 min，用 PBS 清洗
        白分析仪测定蛋白浓度。蛋白经 5×SDS-PAGE 蛋白上                      5 min×3 次，于 0.2％Triton X-100 试剂中静置 5 min，用
        样缓冲液稀释后，于 95～100 ℃变性 5 min。取变性蛋                    PBS 清洗 5 min×3 次，用 5％BSA-PBS 混合溶液封闭 30
        白适量行 SDS-PAGE，电泳结束后湿法转移至 PVDF                      min，把装有玻片的培养板放于自制湿盒中，室温孵育 1
        膜上，用 5％脱脂奶粉室温封闭 1 h，用 TBST 溶液清洗                    h 后，吸弃多余液体。在玻片上滴加相应一抗（CDK5、
        5 min×3 次，加入相应一抗[内参（β-actin）的稀释度为                  GSK3β、Tau的稀释度分别为1 ∶ 500、1 ∶ 300、1 ∶ 200），4 ℃
        1 ∶ 5 000，其余蛋白的稀释度均为 1 ∶ 1 000]，4 ℃孵育过             孵育过夜，用 PBS 清洗 5 min×3 次，加入二抗（稀释度为
        夜；用 TBST 溶液清洗 5 min×3 次，加入二抗（稀释度为                  1 ∶ 1 000），室温避光孵育1 h，用PBS清洗5 min×3次，加
        1 ∶ 10 000），37 ℃摇床避光孵育 2 h，用 TBST 溶液清洗 5           入DAPI试剂50 μL，室温避光孵育5 min。取出玻片，晾
        min×3次后，采用双色红外荧光扫描成像系统成像并使                         干，加入抗荧光淬灭封片剂适量，于荧光倒置显微镜下
        用 ImageJ V1.48u 软件进行定量分析，以相应蛋白与内                   观察目标蛋白的分布情况（目标蛋白呈绿色荧光，细胞
        参条带的灰度值比值表示该蛋白的相对表达量。上述                            核呈蓝色荧光）。
        试验重复3次。                                            2.8  统计学方法
        2.6 CDK5、GSK3β mRNA表达情况检测                              采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
            采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测。取对                     料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way
        数生长期的NG108-15细胞适量，以6×10 个/孔接种于6                    ANOVA）。P＜0.05表示差异有统计学意义。
                                           5
        孔板中，培养24 h。按“2.3”项下方法分组，每组设3个复                     3 结果
        孔。正常对照组加入完全培养基1 mL，各含药组加入含                         3.1 TSG对AD模型细胞存活情况的影响
        相应药物的完全培养基1 mL，继续培养24 h。除正常对                           与正常对照组比较，模型组细胞的存活率显著降
        照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制 AD 细胞模                       低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，TSG
        型。随后采用Trizol法抽提细胞总RNA，使用微量核酸蛋                      各剂量组细胞的存活率均显著升高，差异均有统计学意
        白分析仪检测RNA浓度及纯度（即A260 nm/A280 nm；当A260 nm/          义（P＜0.05），详见表2。
        A280 nm 为 1.8～2.1，表明 RNA 的纯度较高），将提取的               3.2 TSG对AD模型细胞凋亡情况的影响
        RNA按试剂盒步骤进行去DNA和逆转录后，采用两步法                             正常对照组可见大量 VE，呈绿色，且形态未见异
        以实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应体系（共20 μL）：                      常。模型组可见部分VA，呈固缩或圆珠状；经TSG预处
        上/下引物（引物序列见表1）各0.8 µL、模板cDNA 2 µL、                 理后，各给药组VA均有所减少，详见图1（图中，“圆圈”


        中国药房    2019年第30卷第18期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18  ·2487  ·
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