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一种磷酸蛋白，其磷酸化程度是体内多种磷酸化特异                            （GAPDH）扩增引物均由宝生物工程（大连）有限公司设
        性蛋白激酶和脱磷酸化蛋白磷酸酶相互作用平衡的结                             计 、合 成 ；十 二 烷 基 磺 酸 钠 - 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳
        果 。在正常情况下，大部分 Tau 蛋白是不会被磷酸化                        （SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（上海雅酶生物科技有限
           [2]
        的，但在 AD 或其他 Tau 病变（如进行性核上性麻痹、慢                      公司，批号：2017042415）；磷酸酶抑制剂（北京康为世纪
        性创伤性脑病       [3-4] 等）患者大脑中，Tau 蛋白被过度磷酸              生物科技公司，批号：20351）；抗荧光淬灭封片剂[生工生
        化 。由此可见，Tau蛋白磷酸化异常在AD的发病机制                          物工程（上海）股份有限公司，批号：D105FA0005]；青链霉
          [5]
        中发挥了重要的作用，调节 Tau 蛋白表达及其磷酸化水                         素混合液（批号：20170929）、胰蛋白酶消化液（批号：
        平可能成为干预AD进展的有效手段之一。                                 20181109）、RIPA 高效快速裂解液（批号：20171021）、苯
            2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷是一                 甲基磺酰氟（PMSF）（批号：20161025）、吖啶橙/溴乙锭
        种多羟基酚类化合物，简称二苯乙烯苷（TSG）。该化合                         （AO/EB）染色试剂（AO、EB 试剂体积比为 1 ∶ 1，批号：
        物分子式为 C20H22O9，分子量为 406.39，是中药何首乌的                  20161029）、Triton X-100试剂（批号：524A0510）、封闭用
        主要生物活性成分 。有研究指出，TSG具有保护神经、                          山羊血清（BSA，批号：1206C052）、4′，6-联脒-2-苯基吲
                         [6]
        提高学习记忆力、抗衰老、防治 AD、舒张血管、保护肝                          哚（DAPI）试剂（批号：20170927）均购自北京索莱宝科
                                        [7]
        脏、降血脂、抗炎、抗肿瘤等药理活性 。本研究通过冈                           技有限公司；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。
        田酸（OA）诱导致 NG108-15 细胞 Tau 蛋白异常磷酸化，                  1.3 细胞
        模拟 AD 的发病机制以建立 AD 细胞模型，考察了 TSG                          大、小鼠神经瘤混合细胞 NG108-15 购自广州新晋
        对 AD 发病关键物质 Tau 蛋白及其磷酸化水平的影响，                       生物科技有限公司。
        以期揭示该化合物抗 AD 的作用机制，为其临床应用提                          2 方法
        供实验依据和理论支持。                                         2.1  细胞培养与传代
        1 材料                                                    将NG108-15细胞用含10％胎牛血清、1％青链霉素
        1.1  仪器                                             混合液的DMEM高糖培养基（以下简称“完全培养基”）
            3111型CO2细胞培养箱、Nanodrop3000型微量核酸                 于37 ℃、5％CO2培养箱中培养（培养条件下同），每天观
        蛋白分析仪、Micro17R型高速冷冻离心机（美国Thermo                     察细胞生长状态。待细胞融合至85％后，用胰蛋白酶消
        Fisher Scientific公司）；Spectra Max Plus 384型连续光谱      化、吹打，以800 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀加入
        扫描式酶标仪（香港分子仪器公司）；7300型实时荧光定                         完全培养基适量，反复吹打使之成为单细胞悬液，并分
        量聚合酶链反应（PCR）仪（美国 ABI 公司）；CKX-41 型                   装至2～3个培养瓶中，继续培养。
        荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；Odyssey SA型双                   2.2  AD细胞模型复制
        色红外荧光扫描成像系统（美国LI-COR公司）。                                采用 OA 诱导。取对数生长期的 NG108-15 细胞适
        1.2  药品与试剂                                          量，以适宜密度接种至培养板中，培养 24 h。吸弃上清
            TSG 对照品（批号：#017M4703V，纯度：≥98％）、                 液，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，下同）清洗 3 次后，加
        OA（批号：#SLBS1501V）均购自美国Sigma公司；DMEM                  入以完全培养基配制的80 nmol/L OA溶液（浓度根据本
        高糖培养基（美国Gibco公司，批号：8116486）；胎牛血清                    课题组前期预试验结果确定），继续培养24 h以复制AD
        （澳大利亚AusGenex公司，批号：FBSSA00418-2）；MTT                细胞模型。
        试剂（合肥白鲨生物科技有限公司，批号：2016106）；兔                       2.3  细胞增殖情况检测
        源Tau多克隆抗体（批号：00036062）、兔抗小鼠周期蛋白                         采用 MTT 法检测。取对数生长期的 NG108-15 细
                                                                          4
        依赖性激酶 5（CDK5）单克隆抗体（批号：00032730）、兔                   胞适量，以 6×10 个/孔接种于 96 孔板中，培养 24 h。将
        抗小鼠糖原合成酶激酶 3β（GSK3β）单克隆抗体（批号：                       细胞随机分为正常对照组、模型组和TSG低、中、高剂量
        00041503）、兔抗小鼠β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体                  组（50、100、200 μmol/L，剂量设置参考本课题组前期预
        （批号：00057922）均购自美国 Proteinech Group 公司；兔            试验结果），每组设5个复孔。吸弃各孔上清液，正常对
        抗小鼠磷酸化 Tau（p-Tau）单克隆抗体（美国 Cell Signal-              照组加入完全培养基1 mL，各给药组加入含相应药物的
        ing 公司，批号：1）；山羊抗兔 IgG 二抗（美国 Thermo                  完全培养基 1 mL，继续培养 24 h。除正常对照组外，其
        Fisher Scientific公司，批号：C70620-05）；Western一抗稀        余各组均按“2.2”项下方法复制 AD 细胞模型。随后每
        释液（批号：082118180821）、Western二抗稀释液（批号：                孔加入5 mg/L的MTT溶液10 μL，避光孵育4 h，弃去上
        061418180703）均购自碧云天生物技术公司；Trizol试剂                  清液，每孔加入二甲基亚砜100 μL，室温振荡10 min，使
        （批号：AA7101-1）、PCR 试剂盒（含 TBⅡ Premix Ex               用连续光谱扫描式酶标仪于490 nm波长处检测各孔的
                                              ®
        TaqⅡ、ROX Reference Dye 等试剂，批号：AI1777A）、逆            光密度（OD）值，并计算细胞生存率，生存率（％）＝（试
        转录试剂盒（批号：AI12361A）均购自宝生物工程（大                        验组细胞平均 OD 值/正常对照组细胞平均 OD 值）×
        连）有限公司，CDK5、GSK3β、甘油醛-3-硫酸脱氢酶                       100％。上述试验重复3次。


        ·2486  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18                                中国药房    2019年第30卷第18期
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