Page 82 - 2019年2月第30卷第4期
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开放ODS色谱柱[100 mm×4.6 mm，15 µm，YMC（中国）                培养液5 mL，混匀，置于37 ℃、5％CO2细胞培养箱中进
        公司]；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶色谱柱（80 cm×1.3               行培养；每2天更换细胞培养液1次，并于显微镜下观察
        cm，40 µm，英国 GE Healthcare Bio-Science AB 公司）；       细胞形态，备用      [12-14] 。
        HPD100 大孔吸附树脂（粒径：0.3～1.25 mm，沧州宝恩                   2.3.2  活性单体筛选         取“2.3.1”项下对数生长期的
        化工有限公司）；甲醇为色谱纯，石油醚、乙醇、乙酸乙                           HeLa细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液并
                                                                                                   4
        酯、正丁醇、硫酸、二甲基亚砜（DMSO）等试剂均为分析                         计数。用细胞培养液将细胞密度调整至6×10 个/mL，按
        纯，水为去离子水。                                           100 µL/孔接种至 96 孔板中，于 37 ℃、5％CO2条件下培
        1.3 细胞                                              养 24 h 后，将细胞随机分为空白对照组、5-FU 组和各化
            人宫颈癌HeLa细胞由中国科学院上海生命科学研                         合物组（各给药组剂量均为 6.25、12.5、25、50、100、200
        究院细胞资源中心提供。                                         µg/mL，剂量设置均参考文献[15]），空白对照组给予等
        2 方法                                                体积的细胞培养液，其余各给药组给予相应剂量的药物
        2.1 正丁醇萃取部位的提取、分离与纯化                               （均以细胞培养液为溶剂）。每组设置 3 个复孔，于
            取干燥的骆驼刺地上部分9 kg，用70％乙醇以料液                       37 ℃、5％CO2条件下培养48 h后，加入5 mg/mL的MTT
        比1∶10（m/V，kg/L）于70 ℃加热回流提取3次，每次2 h，                 溶液（以生理盐水为溶剂，10 μL/孔）作用 4 h，弃去上清
        合并提取液，减压回收后得浸膏 1 550 g。浸膏加水 9 L                     液，加入 DMSO 适量（100 μL/孔），于摇床上振荡 5～10
        分散，用正丁醇萃取3次，每次9 L，合并萃取液，于50 ℃                       min 使完全混匀。使用全自动酶标仪于 570 nm 波长处
        旋转蒸干，即得正丁醇萃取部位260.0 g，得率为16.77％                     检测各孔的吸光度，计算细胞抑制率（E）[E＝（1－各给
        （按正丁醇萃取部位质量与浸膏质量之比计算）。取上                            药组平均吸光度/空白对照组平均吸光度）×100％]，并推
        述骆驼刺正丁醇萃取部位250 g，经HPD100大孔吸附树                       算半数抑制浓度（IC50，即当存活细胞数减少一半时所需
                                                                      [16]
        脂柱，以乙醇-水（100 ∶ 0～0 ∶ 100，V/V）梯度洗脱，洗脱液               的药物浓度 ），以筛选活性较强（即IC50值相对较小）的
        合并、浓缩，得30％乙醇洗脱部分浸膏120.0 g和90％乙                      单体。上述试验重复3次。
        醇洗脱部分浸膏 75.0 g。取 90％乙醇洗脱部分浸膏                        2.4  细胞划痕实验
        70.0 g，经硅胶（100～200目）柱，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶                    取“2.3.1”项下对数生长期的 HeLa 细胞，用细胞培
                                                                                     5
        1、90 ∶ 1，V/V）梯度洗脱，经薄层色谱鉴别后合并，得4个                    养液将细胞密度调整至 1×10 个/mL，按 400 µL/孔接种
        流份（Fr.1～Fr.4）。Fr.1 经开放 ODS 柱色谱，以甲醇-水                至 48 孔板中，于 37 ℃、5％CO2条件下培养过夜，用 200
        （100 ∶ 1，V/V）洗脱，得Fr.1.1；对Fr.1.1进行制备型高效液             µL 枪头在细胞培养皿中均匀划痕后，用 PBS 清洗 3 次，
        相色谱（色谱柱为 RyC18 ）分离，得化合物Ⅰ（13.4 mg）和                  加入不含 FBS 的细胞培养液（即不含 FBS 的 DMEM 高
        化合物Ⅱ（20.3 mg）。Fr.2 经开放 ODS 柱色谱，以甲醇-                 糖培养基，下同）后，立即使用倒置显微镜拍照（时间点
        水（80 ∶ 1，V/V）洗脱，得 Fr.2.2A 和 Fr.2.2B；对 Fr.2.2A 和     为 0 h）；随后将细胞随机分为空白对照组、5-FU 组和
        Fr.2.2B进行制备型高效液相色谱分离，分别得化合物Ⅲ                       “2.3”项下筛选所得活性较强化合物组（各给药组剂量均
        （13.2 mg）和化合物Ⅳ（12.3 mg）。Fr.3经开放ODS柱色                为 50 µg/mL，剂量设置参考本课题组前期研究成果 及
                                                                                                        [8]
        谱，以甲醇-水（30∶1，V/V）洗脱，得Fr.3.3；对Fr.3.3进行制             “2.3.2”项下测算的IC50值），空白对照组给予等体积的不
        备型高效液相色谱分离，得化合物Ⅴ（13.4 mg）。Fr.4经                     含FBS的细胞培养液，其余各给药组给予相应剂量的药
        开放 ODS 柱色谱，以甲醇-水（5 ∶ 1，V/V）洗脱，得化合物                  物（均以不含FBS的细胞培养液为溶剂）。每组设置3个
        Ⅵ（13.2 mg）。                                         复孔，分别于37 ℃、5％CO2条件下培养24、48 h后，用倒
        2.2 结构鉴定                                            置显微镜观察划痕愈合程度并拍照。与 0 h 相比，48 h
            结 合 熔 点 等 理 化 性 质 ，采 用 质 谱（MS）、氢 谱              时划痕缝隙缩小的差值即为HeLa细胞的迁移距离                    [17-18] 。
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        （H-NMR）、碳谱（ C-NMR）、红外（IR）等波谱手段对化                    上述试验重复3次。
        合物Ⅰ～Ⅵ进行结构鉴定。                                        2.5 联合用药效果评价
        2.3 抗HeLa细胞增殖活性单体的筛选                                    取“2.3.1”项下对数生长期的 HeLa 细胞，用细胞培
        2.3.1  细胞培养      将 HeLa 细胞从液氮中取出，迅速置                养液将细胞密度调整至 1×10 个/mL，按 100 µL/孔接种
                                                                                     5
        于37 ℃水浴锅中解冻，取适量至离心管中，加入细胞培                          至96孔板中，于37 ℃、5％CO2条件下培养过夜后，将细
        养液（含 10％FBS 的 DMEM 高糖培养基，下同）3 mL，                   胞随机分为5-FU联合“2.3”项下筛选所得活性较强化合
        以 1 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，将沉淀重悬于                  物的不同剂量组[（3.125+6.25）、（6.25+12.5）、（12.5+25）、
        细胞培养液1 mL中，并转移至细胞培养瓶内，加入细胞                         （25+50）µg/mL；剂量设置参考本课题组前期研究成


        ·508  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 4                                   中国药房    2019年第30卷第4期
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