Page 48 - 2019年2月第30卷第4期

功能性消化不良（Functional dyspepsia，FD）是无明 min；滤过，合并 3 次滤液，于 60 ℃缓慢蒸发至每毫升药
显胃器质性病变并以上腹部疼痛或不适、饱胀、嗳气不 液相当于原药材 1 g（动物实验时给药剂量以原药材量
舒、呕逆等为临床症状的消化系统疾病；其在临床上常 计），在4 ℃条件下保存备用。
表现为胃排空延迟，部分表现为胃液体排空延迟 。FD 1.4 动物
[1]
的症状表现可归属于中医的胃虚饮停证的范畴。作为 SD 清洁级大鼠 60 只，雌雄各半，体质量 180～220
治疗胃虚饮停证的代表方剂茯苓甘草汤，我国中医经典 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供[动物生产许可证
《伤寒论》中记载其具有温胃化饮的功效，主治心下悸、 号：SCXK（湘）2014-0011]，由贵阳中医学院 SPF 级实验
胃中痞满、胃中有振水声等。本课题组前期研究也发 室饲养[动物饲养许可证号：SYXK（黔）2012-0001]。室
现，茯苓甘草汤能显著促进FD模型大鼠胃中液体排空， 温设为（20±2）℃，动物固体颗粒饲料由长沙天勤生物
其作用可能与提高胃底乙酰胆碱酯酶（AChE）含量、降 技术有限公司提供。
低胃底一氧化氮（NO）含量的机制有关 。已有研究证 2 方法
[2]
实，FD 的发生过程中常伴有胃黏膜组织中多种蛋白的 2.1 分组、造模和给药
异常表达 [3-4] 。基于此，本实验通过考察茯苓甘草汤干预 取大鼠60只，随机分为正常组、模型组、茯苓甘草汤
治疗 FD 模型大鼠后对其胃黏膜组织中水通道蛋白 3 高剂量组（20 g/kg）、茯苓甘草汤低剂量组（10 g/kg）、联
（AQP3）、胃促生长素（Ghrelin）、P物质（Substance P）、紧 用组（茯苓甘草汤10 g/kg+多潘立酮0.004 g/kg）、多潘立
密连接蛋白 1（Claudin-1）、闭锁蛋白（Occludin）、血管活 酮组（0.004 g/kg），每组 10 只。正常组大鼠灌胃常温蒸
性肠肽（VIP）蛋白表达的影响，探讨茯苓甘草汤治疗FD 馏水 0.8 mL，其余各组大鼠根据文献[2]灌胃温度为
的作用机制，以期为该方剂的进一步开发和临床应用提 0 ℃、浓度为 0.5 mol/L 的稀盐酸 0.8 mL 建立大鼠 FD 模
供实验依据。 型。连续灌胃14 d后，正常组和模型组大鼠灌胃等体积
1 材料 常温蒸馏水，其余各组大鼠灌胃常温相应浓度的药物溶
1.1 仪器 液1 mL/100 g（药品/药液均以蒸馏水稀释至适当浓度），
FA124型电子分析天平（上海邦西仪器科技有限公 每天1次，连续7 d。
司）；KD-202A型石蜡切片机（浙江科迪仪器设备有限公 2.2 大鼠胃排空功能检查
司）；CX21 型光学显微镜（日本 Olympus 公司）；Power- 末次给药前，各组大鼠先禁食8 h，然后给予半流质
PAC Basic型电泳仪（美国Bio-Rad公司）。 饲料（固体颗粒饲料捣碎后加水调配）和碳粉混合物（2
1.2 药品与试剂 g/只），10 min后再给予蒸馏水或相应药物。给药30 min
多 潘 立 酮 片（西 安 杨 森 制 药 有 限 公 司 ，批 号 ： 后，处死大鼠，取胃组织在洗净前后分别称定质量，并计
170306533，规格：10 mg）；AQP3、Ghrelin、Substance P、 算胃内残渣量（胃内残渣量＝胃总质量－胃净质量），以
Claudin-1、Occludin、VIP和β-肌动蛋白（β-actin）抗体（一 评价大鼠胃排空功能。
抗，英国 Abcam 公司，批号分别为 ab125219、ab209790、 2.3 大鼠胃黏膜组织中AQP3、Ghrelin、Substance P的
ab216414、ab15098、ab216327、ab8556、ab8227）；山羊抗 蛋白表达水平检测
兔辣根过氧化酶抗体（二抗）、磷酸缓冲盐溶液（PBS， 采用免疫组化SP法检测。取“2.2”项下各组5只大
pH7.2～7.4）（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分 鼠的胃组织，放入4％多聚甲醛中固定后，以自来水冲洗
别为 109525、ZLI-9062）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 4 h，再以不同体积分数的乙醇（由低到高）分别脱水1 h；
（SDS-PAGE）凝胶制备试剂盒、BCA 蛋白浓度定量试剂 二甲苯透明20 min×2次；液体石蜡中浸蜡1.5 h×2次，包
盒、ECL 超敏发光液、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、二 埋，切片（厚度为 6 μm）；以常规二甲苯脱蜡 15 min×2
氨基联苯胺（DAB）显影剂（北京索莱宝生物科技有限公 次，以不同体积分数的乙醇（由高到低）分别水化；PBS
司 ，货 号 分 别 为 G1120、PC0020、PE0010、G1120、 浸泡5 min，3％过氧化氢封闭10 min；PBS冲洗后分别滴
DA1010）；Minute TM 动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒 加 AQP3、Ghrelin、Substance P 抗体（1 ∶ 100），4 ℃孵育
[ 英 文 特 生 物（北 京）技 术 有 限 公 司 ，货 号 ：SD-001/ 12 h 后滴加二抗（1 ∶ 300）；DAB 显色，自来水冲洗，苏木
SN-002]；水为自制蒸馏水（pH7.2～7.4）。 素复染，脱水，透明并封片镜检。于显微镜下观察胃黏
1.3 药材 膜组织中目的蛋白表达情况，阳性表达呈棕黄色。每组
茯苓、桂枝、甘草（炙）、生姜均购自贵州同济堂药业 各蛋白随机选择5张切片，每张切片随机选择3个视野，
有限公司，经贵阳中医学院董丽莎教授鉴定为正品。茯 采用 Image Pro Plus 6.0 软件分析光密度值以表示蛋白
苓甘草汤按《伤寒论》原方比例配伍：茯苓 30 g、桂枝 30 表达水平。
g、炙甘草 15 g、生姜 45 g。取按此比例配伍好的药材 2.4 大鼠胃黏膜组织中 Claudin-1、Occludin、VIP 蛋白
100 g，分次加水 1 000、800、800 mL 煎煮 3 次，每次 40 表达水平检测

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