Page 24 - 2019年2月第30卷第4期

由广州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证 表1 引物序列
号：SYXK（粤）2016-0023。所有大鼠均在环境温度 Tab 1 Primer sequences
（25±1）℃、湿度68％、12 h光照/黑暗交替的清洁环境中 基因名称 引物序列 扩增长度，bp
饲养，任意进食标准饲料和自来水。本实验方案通过广 GAPDH 5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′ 98
5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3′
州中医药大学动物实验伦理审查。
Smad1 5′-GGGACTGCCTCATGTCATTTA-3′ 119
2 方法 5′-AGACTTCCTTCTGCTTGGAAC-3′
2.1 分组、造模和给药 BMP2 5′-CAGTGGGAGAGCTTTGATGT-3′ 108
5′-ACCTGGCTTCTCCTCTAAGT-3′
将大鼠随机分为正常对照组、模型组、川芎嗪组，每
VEGF 5′-GAAGACACAGTGGTGGAAGAAG-3′ 111
组6只。对模型组、川芎嗪组大鼠采用关节腔注射木瓜 5′-ACAAGGTCCTCCTGAGCTATAC-3′
蛋白酶建立 KOA 模型：在无菌条件下以生理盐水配制 U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′
4％木瓜蛋白酶溶液，于 4 ℃保存，在实验开始前 4 h 取
miR-20b 5′-CGAAAGTGCTCATAGTGCAGG-3′ 61
出放至室温备用；对大鼠腹腔注射 10％水合氯醛麻醉 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′
后，在其双膝关节处备皮、消毒并屈曲约 45°，从髌骨下 表2 PCR扩增条件
缘前内侧的膝眼向髁间窝方向进针，待明显有落空感
Tab 2 PCR amplification conditions
后，针尖抵达股骨内侧髁再回撤 2 mm，然后注射 4％木
循环次数 步骤 温度 时间
瓜蛋白酶溶液（双侧膝关节腔均注射0.2 mL），在第1、4、 1 预变性 95 ℃ 10 min
7天分别注射1次，共注射3次 。正常对照组大鼠同法 40 变性 95 ℃ 10 s
[10]
退火 55 ℃ 20 s
注射等体积生理盐水。自造模第1天起，每天驱赶大鼠
延伸 72 ℃ 35 s
活动2次，每次1 h，连续驱赶1周。
采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下部分冻
末次注射木瓜蛋白酶或生理盐水第 2 天起，川芎嗪
存膝关节组织，采用全蛋白提取液（RIPA裂解液-蛋白酶
组大鼠灌胃川芎嗪混悬液（100 mg/kg，参考文献[11]确
抑制剂混合物-蛋白磷酸酶抑制剂混合物-PMSF的体积
定剂量；取川芎嗪片以生理盐水配制成适当浓度后给
比为100 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）提取软骨下骨全蛋白，采用Bradford比
药）2 mL，正常对照组、模型组大鼠灌胃等体积生理盐
色法测定蛋白浓度。离心收集软骨下骨全蛋白，加入
水，每天1次，连续6周。
2.2 大鼠软骨组织大体情况和组织病理学观察 SDS 蛋白上样缓冲液×5 次，95 ℃孵育 5 min，在－20 ℃
条件下保存备用。分别采用浓缩胶和分离胶进行蛋白
给药结束后，断颈处死全部大鼠，解剖双侧膝关节
电泳，235 mA 转膜 60～120 min，5％脱脂奶粉封闭 1 h。
并暴露关节软骨，大体观察关节软骨光滑度、色泽，表面
将 PVDF 膜分别放入 VEGF、BMP2、Smad1、β-actin 抗体
是否有糜烂、溃疡及纤维性增生，边缘是否有骨赘形成
稀释液（1 ∶ 1 000）3 mL 中，4 ℃孵育过夜，次日以 TBST
等情况。剔除膝关节周围的肌肉组织，在胫骨近端 1/4
至股骨远端1/4的范围截取整个膝关节。一部分膝关节 缓冲液洗膜 5 min×4 次；再将 PVDF 膜放入二抗稀释液
组织于－80 ℃条件下保存备测；另一部分膝关节组织在 （1 ∶ 20 000）3 mL 中，室温下平缓摇动孵育 1 h 后，以
4 ℃条件下置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，然后脱钙、 TBST 缓冲液洗膜 5 min×4 次；采用 ECL 发光液显色。
脱水、透明、浸蜡、包埋制成石蜡标本，行厚切片（4～6 采用 Image J 1.46r 软件对蛋白条带进行分析，以β-actin
μm）。切片以 HE 染色后在显微镜下观察；采用改良的 为内参计算相对灰度值，以表示蛋白表达水平。
[12]
Mankin’s 评分 对软骨组织结构、细胞、染色以及潮线 2.5 统计学方法
的完整性进行组织学评分，评分范围为0～13分，评分越 所有试验至少独立重复3次。采用GraphPad Prism 7
高表明软骨退变越严重。 统计软件进行数据处理。计量资料以x±s表示，多组间
2.3 大鼠软骨下骨组织中 VEGF、BMP2、Smad1 的 比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey’s或
mRNA和miR-20b表达水平检测 Dunnett’s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
采用逆转录（RT）-PCR 法进行检测。取“2.2”项下 3 结果
部分冻存膝关节组织，采用 Trizol 试剂分别提取软骨下 3.1 大鼠关节软骨大体情况及组织病理学观察结果
骨总RNA和mRNA，采用反转录试剂盒制得cDNA第一 肉眼观察可见，与正常对照组比较，模型组和川芎
链，然后行RT-PCR扩增，引物序列见表1，扩增条件见表 嗪组大鼠的关节均出现不同程度的软骨损伤，包括关节
2。 采 用 2 － Δ Δ Ct 法 ，以 GAPDH 为 内 参 计 算 VEGF、 软骨光滑度下降、色泽变暗淡，表面不平整并伴有糜烂，
[13]
BMP2、Smad1 的 mRNA 表达水平，以 U6 为内参计算 无骨赘形成。但两组间大体情况无明显差别。组织切
miR-20b的表达水平。 片 HE 染色后在镜下可见，正常对照组大鼠关节软骨结
2.4 大鼠软骨下骨组织中 VEGF、BMP2、Smad1 的蛋 构清晰，软骨表面完整、光滑，基质染色基本均匀；模型
白表达水平检测 组大鼠关节软骨浅表层纤维化，表面完整性被破坏，软

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