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0.05），提示SCHE-1可能为返魂草免疫增强活性的有效 以葡萄糖醛酸为对照品，采用紫外可见分光光度计测定
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组分。 吸光度并计算糖醛酸含量 ；采用Lowry法，以牛血清白
表 1 不同剂量 SCHE 对 RAW264.7 细胞活性的影响 蛋白为对照品，采用紫外可见分光光度计测定吸光度并
（x±±s，n＝5） 计 算 蛋 白 质 含 量 [10] 。 结 果 显 示 ，SCHE-1 含 中 性 糖
Tab 1 Effects of different dose of SCHE on 40.05％、糖醛酸35.62％、蛋白质8.89％。因蛋白质含量
RAW264.7 cell activity（x±±s，n＝5） 远低于中性糖和糖醛酸，故 SCHE-1 主要由中性糖和糖
组别 细胞活性，％ 组别 细胞活性，％ 醛酸组成。
阴性对照组 100.00±0.00 SCHE-1高剂量组 163.38±29.18 ＊＊ 2.4 SCHE-1的分子量测定
LPS组 168.54±40.48 ＊＊ SCHE-2低剂量组 111.27±8.36
SCHE-1低剂量组 149.11±27.11 ＊＊ SCHE-2高剂量组 112.36±14.67 2.4.1 色谱条件 色谱柱：Sepax SRT SEC-100 HPLC凝
＊＊
注：与阴性对照组比较， P＜0.01 胶分析柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流动相：0.7％硫酸钠
＊＊
Note：vs. negative control group， P＜0.01 溶液；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；检测器：示差折光
2.2.2 ELISA 法 检 测 RAW264.7 细 胞 中 IL-1 β 、IL-6、 检测器；进样量：10 μL。
TNF-α水平 取处于对数生长期的 RAW264.7 细胞，以 2.4.2 标准曲线的绘制 分别称取分子量为 12 000、
1×10 个/mL 的密度接种于 12 孔板上，每孔 1 mL，置于 5 000、1 000 Da 的葡聚糖和葡萄糖对照品，加流动相溶
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37 ℃、5％CO2培养箱中培养过夜后，将其分为阴性对照 解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，制得质量浓度为10 mg/mL
组、LPS组及SCHE-1、SCHE-2低、高剂量组，每组设置5 的对照品溶液，备用。取上述对照品溶液 10 μL，按
个复孔，分别加入培养基、LPS和相应浓度的样品后，置 “2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰的保留时
于37 ℃、5％CO2培养箱中培养24 h，吸取各组细胞培养 间。以色谱峰的保留时间（x，min）为横坐标、对照品分
液，以 3 000 r/min 离心 5 min，取上清液，采用相应试剂 子量的对数值（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程
盒测定IL-1β、IL-6、TNF-α水平。采用SPSS 13.0软件对 为 y＝－ 0.005 4x + 0.207x － 3.808 0x + 24.747 9（r＝
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数据进行统计分析，统计学方法同“2.2.1”项下方法。不 0.999 9）。
同剂量 SCHE 对 RAW264.7 细胞中 IL-1β、Il-6、TNF-α水 2.4.3 供试品溶液的制备 称取 SCHE-1 样品适量，加
平的影响见表2。 流动相溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，制得质量浓度为
表 2 不同剂量SCHE对RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6、 5 mg/mL的供试品溶液。
TNF-α水平的影响（x±±s，n＝5，pg/mL） 2.4.4 方法学考察 （1）精密度试验。取“2.4.2”项下对
Tab 2 Effects of different dose of SCHE on the levels 照品溶液适量，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样测定 6
of IL-1β，IL-6 and TNF-α in RAW264.7 cells 次，记录分子量。结果，重均分子量的 RSD 为 1.01％
（x±±s，n＝5，pg/mL） （n＝6），表明仪器精密度良好。（2）稳定性试验。取
组别 IL-1β IL-6 TNF-α “2.4.3”项下供试品溶液（批号：20170715）适量，分别于
阴性对照组 33.67±9.09 17.85±6.69 167.65±6.91 ＊＊ 室温下放置 0、30、60、90、120、150 min 时按“2.4.1”项下
LPS组 68.39±4.93 ＊＊ 92.55±15.54 ＊＊ 1 814.41±65.53 ＊＊
SCHE-1低剂量组 57.28±6.70 ＊＊ 35.42±5.57 ＊＊ 1 069.41±92.86 ＊＊ 色谱条件进样测定，记录分子量。结果，重均分子量的
SCHE-1高剂量组 55.61±4.26 ＊＊ 40.35±7.49 ＊＊ 1 362.21±110.52 ＊＊ RSD 为 1.98％（n＝6），表明供试品溶液于室温下放置
SCHE-2低剂量组 45.89±4.48 20.80±12.84 846.03±42.11 ＊＊
SCHE-2高剂量组 43.11±7.93 19.89±9.70 886.03±132.22 ＊＊ 150 min 内基本稳定。（3）重复性试验。取 SCHE-1 样品
适量，共 6 份，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，再按
＊＊
注：与阴性对照组比较， P＜0.01
Note：vs. negative control group， P＜0.01 “2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录分子量。结果，重
＊＊
由表 2 可知，与阴性对照组比较，LPS 组及 SCHE-1 均分子量的 RSD 为 1.51％（n＝6），表明本方法重复性
低、高剂量组均可显著提高 RAW264.7 细胞中 IL-1β、 良好。
IL-6、TNF-α水平（P＜0.01）；SCHE-2 低、高剂量组均可 2.4.5 分子量的测定 “按 2.4.2”“2.4.3”项下方法分别
显著提高TNF-α水平（P＜0.01），而对IL-1β、IL-6水平则 制备对照品溶液和供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条
无显著影响（P＞0.05），提示SCHE-1是返魂草免疫增强 件 进 样 测 定 ，并 利 用 GPC 软 件 计 算 其 分 子 量 [11] 。
活性的有效组分。 SCHE-1 分子量测定结果见图 1。由图 1 可见，SCHE-1
2.3 SCHE-1理化性质考察 的 HPLC 图显示有多个峰，提示 SCHE-1 是由不同分子
根据“2.2”项下研究结果，SCHE-1 是返魂草的免疫 量物质组成的混合物，其分子量范围为 62～6 119 Da，
增强活性组分，故对其组成进行进一步研究。采用苯 重均分子量为5 864 Da。
酚-硫酸法，以葡萄糖为对照品，采用紫外可见分光光度 2.5 SCHE-1的单糖组成分析
计测定吸光度并计算中性糖含量 ；采用间羟基联苯法， 2.5.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18 （250 mm×4.6
[8]

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