Page 58 - 《中国药房》2026年5期

组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水，每天 1 次，连 表1 PCR引物序列和扩增产物长度
续6周。 引物名称 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
HIF-1α 正向：CTTGGAAACGAGTGAAAGGATACA 183
2.2 样本采集及处理
反向：GGTTTCTGCTGCCTTGTATGG
末次灌胃给药后，所有大鼠禁食不禁水 24 h，然后 Keap1 正向：GAGATATGAGCCAGATCGAGACG 183
放入代谢笼中收集24 h尿液。尿液收集完毕后，麻醉大 反向：GGTGTAATCATCCGCCACTCAT
GAPDH 正向：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138
鼠，于腹主动脉取血并分离上层血清，保存备用。取血 反向：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
完成后，处死大鼠，然后剥离其双侧肾脏，将一部分肾组 miR-155-5p 正向：ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT 67
反向：TGGTGTCGTGGAGTCG
织置于 4% 多聚甲醛溶液中固定，剩余部分经液氮快速
Nrf2 正向：AATTGCCACCGCCAGGACT 100
冷冻后于－80 ℃冰箱中冻存，待检。 反向：TCAAACACTTCTCGACTTACCCC
U6（内参） 正向：CTCGCTTCGGCAGCACA 94
2.3 大鼠肾组织病理学形态观察
反向：AACGCTTCACGAATTTGCGT
取“2.2”项下于 4% 多聚甲醛溶液中固定的肾组织
孵育过夜；次日，加入相应二抗（稀释比例为 1∶5 000），
适量，经脱水、石蜡包埋、切片（厚度约4 μm）后，进行苏
于室温下孵育 30 min；经发光液显色处理后，置于化学
木素-伊红（HE）染色；将染色后的切片脱水、封片后，采
发光仪中曝光显影，采用 AIWBwell 软件分析蛋白条
TM
用光学显微镜观察大鼠肾组织病理学形态，如肾小球、
带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比
肾小管、肾间质等的病理学改变。
值，表示目的蛋白的表达水平。
2.4 大鼠24 h-UTP及血清中生化指标水平检测
2.8 统计学方法
取“2.2”项下收集的24 h尿液和血清样品，采用全自
采用SPSS 27.0软件进行统计分析。符合正态分布
动生化分析仪检测大鼠尿液中 24 h-UTP 水平和血清中
的数据以 x±s 表示，若方差齐，多组间比较采用单因素
白蛋白（albumin，ALB）、血尿素氮（blood urea nitrogen，
方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验；若方差
BUN）、肌酐（serum creatinine，SCr）、总胆固醇（total cho‐
不齐，则采用 Dunnett’s T3 法进行组间两两比较。检验
lesterol，CHOL）、甘油三酯（triglyceride，TG）水平。
水准α＝0.05。
2.5 大鼠肾组织中氧化应激指标检测
每组取 3 只大鼠的肾组织适量，根据试剂盒说明书 3 结果
3.1 TWM对大鼠肾组织病理学形态的影响
方法操作，采用生化比色法检测其中SOD、MDA水平。
2.6 大鼠肾组织中 HIF-1α/miR-155-5p/Nrf2 信号通路 空白组大鼠肾组织结构清晰，未见明显炎症细胞浸
相关mRNA表达检测 润，肾小球分布均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，肾间
每组取3只大鼠的肾组织适量，冰上研磨后，提取总 质未见明显增生。模型组大鼠肾组织结构紊乱，可见较
RNA，再反转录为 cDNA。以 cDNA 为模板进行 PCR 扩 多纤维结缔组织增生伴淋巴细胞浸润；肾小球少量坏
增，PCR 扩增体系为 cDNA 模板 2.0 μL，SYBR Green 死，局部出现肾小球毛细血管淤血，且伴有基质增加；肾
qPCR 预混液 7.5 μL，正、反向引物各 1.5 μL，无酶无菌 小管上皮细胞水肿，细胞质疏松淡染，大量肾小管扩张，
水 4.0 μL。PCR 扩增条件为 95 ℃预变性 30 s；95 ℃变 且形成蛋白管型。泼尼松组和TWM各剂量组大鼠肾小
性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 管上皮水肿、肾小管扩张等病理变化相较于模型组均明
为内参，采用2 －△△Ct 法计算目的基因mRNA的表达水平。 显改善。结果见图1。
本研究引物序列由武汉赛维尔生物科技有限公司设计
并合成，具体信息见表1。
2.7 大鼠肾组织中 HIF-1α/miR-155-5p/Nrf2 信号通路
相关蛋白表达检测 A.空白组 B.模型组 C.泼尼松组
每组取3只大鼠的肾组织适量，加入RIPA裂解液裂
解，于 4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 10 min，提取总蛋
白；采用 BCA 法测定蛋白浓度后，将蛋白进行变性处
理；取变性后蛋白适量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
D. TWM高剂量组 E. TWM低剂量组
胺凝胶电泳、转膜，再于室温下以 5% 的脱脂牛奶封闭 注：黑色箭头所指为肾小管扩张；黄色箭头所指为肾小球毛细血
30 min；加入 HIF-1α、Keap1、Nrf2、β-actin 一抗（稀释比 管淤血；红色箭头所指为淋巴细胞浸润。
例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），于4 ℃下 图1 各组大鼠肾组织病理学形态的显微图（HE染色）

· 604 · China Pharmacy 2026 Vol. 37 No. 5 中国药房 2026年第37卷第5期