Page 58 - 《中国药房》2026年2期
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[9]
          2 方法                                                程度＜50%）、3分（损伤程度≥50%） 。
          2.1 建模及分组                                           2.5.2 肾组织中糖类物质观察
              待大鼠饲养 1 周后，将雌性和雄性大鼠按照 2∶1 的                         取“2.5.1”项下各组孕鼠的肾组织切片，脱蜡水化
          比例合笼喂养。当观察到阴栓或阴道涂片中存在精子                             后，经过碘酸溶液、Schiff 试剂以及苏木精处理后，脱水
          时，判定为妊娠雌鼠（共30只），并将此日定义为妊娠第0                         封片，使用显微镜观察 PAS 阳性区域（紫红色区域），以
          天。随后，妊娠雌鼠每日腹腔注射L-NAME（50 mg/kg），                    此衡量肾组织中多糖和糖蛋白沉积等情况。通过
          连续注射14 d以诱导PIH。通过标准尾部测压法检测孕                         Image J 软件计算 PAS 阳性面积百分比，阳性面积百分
          鼠收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（dia‐          比＝PAS 阳性区域的像素面积/所分析区域的总像素面
          stolic  blood  pressure，DBP），若 SBP≥140  mmHg（1      积×100%。
          mmHg＝0.133 kPa）且较造模前升高≥25%，同时DBP≥                   2.6 肾组织中氧化应激指标检测
          90 mmHg、24 h 尿蛋白（比色法检测）＞30 mg，判定为                       取“2.3”项下各组孕鼠冻存的肾组织，匀浆处理后收
          PIH 孕鼠模型构建成功（共 24 只） 。另取 6 只体重、月                    集上清，按照 ELISA 试剂盒说明书操作，使用酶标仪检
                                       [9]
          龄相匹配的妊娠雌鼠，在相同时间段内每日腹腔注射等                            测450 nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算SOD、
          体积生理盐水，作为空白组。将24只PIH孕鼠随机分为                          MDA、GSH-Px、8-OHdG浓度。
          模型组、低剂量茯苓酸（低-茯苓酸）组、高剂量茯苓酸                           2.7 肾组织中Sirt1/PGC-1α通路相关蛋白的基因表达
         （高-茯苓酸）组、高-茯苓酸+EX527组，每组6只。低-茯
                                                              检测
          苓酸组和高-茯苓酸组孕鼠分别每日灌胃茯苓酸 10、20
                                                                  采用 qRT-PCR 法进行检测。取“2.3”项下各组孕鼠
                                                [10]
          mg/kg（以0.5%羧甲基纤维素钠溶液为溶剂） ，高-茯苓
                                                              冻 存 的 肾 组 织 ，以 Trizol 法 提 取 总 RNA，逆 转 录 为
          酸+EX527组孕鼠在灌胃20 mg/kg茯苓酸同时每日腹腔
                                                              cDNA。以 cDNA 为模板进行 qRT-PCR 扩增反应，反应
                                               [11]
          注射EX527（10 mg/kg，以生理盐水为溶剂） ，空白组和
                                                              体系（20 μL）包含 2×SYBR Green Master Mix 10 μL、
          模型组孕鼠每日灌胃等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶
                                                              cDNA 2 μL、正反向引物各 1 μL、无核酸酶水 6 μL。扩
          液，每日1次，连续28 d。
                                                              增条件为 95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 15 s，58 ℃退火
          2.2 24 h尿蛋白和血压检测
                                                              延伸 30 s，共 40 个循环。以 β-actin 为内参，采用 2       －ΔΔct 法
              末次给药后，将各组孕鼠置于代谢笼中，收集 24 h
                                                              计算 Sirt1、PGC-1α mRNA 的表达水平。引物由生工生
          尿液，按试剂盒说明书操作，检测24 h尿蛋白。同步，采
                                                              物工程（上海）股份有限公司合成，Sirt1的正向引物序列
          用标准尾部测压法连续测量孕鼠 3 次尾动脉 SBP，取平
                                                              为 5′-CTGGCATCTCTGGTTCTTGC-3′，反向引物序列
          均值。
                                                              为 5′-TGGCAAGAGAGAGGCATTTG-3′（扩增产物长
          2.3 样本采集
                                                              度 178 bp）；PGC-1α 的正向引物序列为 5′-GAAGAAG-
              血压检测完成后，将各组孕鼠麻醉后腹主动脉取
                                                              AGGAAGCGGTGGA-3′，反向引物序列为5′-TGCATT-
          血，离心后收集血清，用于肾功能指标检测。各组孕鼠
                                                              TCTTCCAGCTTCCA-3′（扩增产物长度156 bp）；β-actin
          取血后腹腔注射 2% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，
                                                              的正向引物序列为 5′-GACCTCTATGCCAACACAGT-
          迅速摘取双侧肾脏。左侧肾脏置于多聚甲醛中固定，用
                                                              3′，反向引物序列为5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-
          于 HE 染色和 PAS 染色；右侧肾脏保存于－80 ℃冰箱
          中，用于氧化应激指标、qRT-PCR和Western blot检测。                  3′（扩增产物长度162 bp）。
          2.4 血清中肾功能指标检测                                      2.8 肾组织中Sirt1/PGC-1α通路相关蛋白表达检测
              取“2.3”项下各组孕鼠的血清样本，按照试剂盒说明                           采用Western blot法进行检测。取“2.3”项下各组孕
          书操作，通过全自动生化分析仪检测血清中 Scr、BUN、                        鼠冻存的肾组织，用 RIPA 裂解后提取蛋白，定量后变
          UA、Cys-C水平。                                         性。将变性蛋白分离、转膜、封闭后，加入Sirt1、PGC-1α
          2.5 肾组织病理学观察                                        和β-actin抗体（稀释比例均为1∶1 000），低温孵育过夜；
          2.5.1 肾组织形态观察                                       次日，加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h
              取“2.3”项下各组孕鼠用多聚甲醛固定的肾组织，常                       后进行 ECL 显影处理，使用 Image J 软件分析条带灰度
          规脱水后进行石蜡包埋，切片（厚度4 μm），经脱蜡、HE染                       值。以目的蛋白与内参（β-actin）的灰度值比值表示目的
          色、透明化处理后，使用显微镜观察肾小球和肾小管结构                           蛋白的表达水平。
          变化，并进行半定量评分。肾小球硬化指数评分——0分                           2.9 统计学处理
         （无硬化）、1 分（硬化程度＜25%）、2 分（25%≤硬化程                          采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析。计量资料以
                                                              -
          度＜50%）、3分（硬化程度≥50%）；肾小管损伤评分——                       x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          0 分（无损伤）、1 分（损伤程度＜25%）、2 分（25%≤损伤                   两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。


          · 188 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 2                               中国药房  2026年第37卷第2期
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